利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统获得富含番茄红素的番茄株系外文翻译资料

 2023-01-04 10:23:19

利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统获得富含番茄红素的番茄株系

原文作者 Xindi Li1,Yanning Wang1,Sha Chen2, Huiqin Tian1, Daqi Fu1, Benzhong Zhu1, Yunbo Luo1 and Hongliang Zhu1*

单位 中国农业大学食品科学与营养工程学院；北京市中文鉴定与安全评价重点实验室；中国中医科学院中药研究所

鉴于番茄红素对人类的视觉和眼部功能具有重要的作用，以往大多研究都集中在选育番茄红素累积的植株上。在本研究中，我们使用了一个双向策略：既促进番茄红素的生物合成，同时又抑制番茄红素向beta;-和alpha;-胡萝卜素转换。番茄红素的积累是通过敲除与类胡萝卜素代谢途径相关的基因来实现的。最后，利用农杆菌介导的遗传转化手段，利用CRISPR/Cas9系统选择5个基因进行编辑。我们的研究表明CRISPR/Cas9是一种位点特异性的基因组编辑技术，可在多个相关基因中高效地实现目标基因的突变。有意思的是，番茄基因编辑株系上番茄红素的含量增加约5.1倍。纯合子突变可在子代中稳定遗传。综上所述， 借助CRISPR/Cas9系统高效的基因编辑效应、罕见的脱靶以及稳定的遗传等优点，可以显著提高果实中番茄红素的含量。

关键词:番茄红素，CRISPR/Cas9系统，基因组编辑，番茄果实，类胡萝卜素代谢途径

前言

通过靶序列上产生特定的修饰进行基因组的编辑，为农作物性状的改良提供了优势。基于原核特异性自适应免疫系统的研究，我们开发了具有特定间隔的聚类回文重复序列 （CRISPR/Cas9），在该系统中，内切酶Cas9与合成的单一导向RNA （sgRNA）结合，产生RNA导向的核酸酶。Cas9靶标DNA双链切割的特异性，导致核DNA中的双链断裂（DSBs），由导向RNA（gRNA）上的20bp引导序列和PAM的Watson-Crick碱基对紧邻目标区域的下游。CRISPR/Cas9诱导的DSBs可以触发两种独立的内源性DNA修复途径：NHEJ和HR。NHEJ容易出错并经常引起DSB周围的插入缺失，通过使用同源序列或外源供体DNA来精确修复DSBs，这常常导致染色体变小或变大(Sonoda等，2006；Wyman和Kanaar，2006；Gaj等，2013；Voytas，2013)。CRISPR/Cas9基因组位点特异性编辑技术是一种新的基因组修饰工具，已成功应用于多种植物，包括水稻(Miao等，2013），小麦(Shan等，2013；Wang等，2014),玉米(Liang等，2014),和番茄（Brooks等，2014；Cermak等，2015；Ma 等，2015； Ito 等，2015；Jacobs and Martin，2016；Lin 等2016；Xu et 等，2016）。与以前的基因组编辑工具（如ZFN和TALEN）不同，CRISPR/Cas9更容易使用，设计更灵活，而且成本更低。CRISPR/Cas9基因组编辑工具具有高的突变效率（Xu等，2015），由于稳定的遗传，所需位点的纯合突变可以转移到后代（Zhang等，2014； Fan 等，2015）。此外，在CRISPR/ cas9介导的靶向突变后，几乎所有的T1代水稻都出现了转基因阴性植株（Xu 等，2015），促进了CRISPR/Cas9的应用。CRISPR/Cas9也广泛应用于番茄中，CRISPR/Cas9介导的突变具有多样性，CRISPR / Cas9可以快速携带多个gRNA，并且能够有效地生成基因的数十个等位基因，以便更好地解释它们的功能（Rodriguez-Leal等，2017）。CRISPR/Cas9介导的敲除很重要（Ito 等，2015）。该报道的CRISPR/Cas9系统可以诱导番茄红素基因突变，影响蛋白质的积累（Yang 等，2017）。其结果表明，CRISPR/Cas9敲除RNA编辑因子SlORRM4后，突变体的成熟明显受到抑制。而且CRISPR/Cas9基因组编辑也有一定的局限性，基因型无法人为控制，需要经过几代才可得到大量的纯合子。

番茄红素被认为是治疗慢性疾病、降低癌症和心血管疾病风险的生物活性成分 （Li and Xu, 2014； Pouchieu 等，2014；Tang 等， 2014）；许多研究试图阐明番茄红素代谢有关的途径。番茄红素是一种C40类胡萝卜素，是果实成熟过程中通过类胡萝卜素的代谢合成（图1A）。类胡萝卜素生物合成依赖于异戊基二磷酸(IPP)及其异构体DMAPP（Chappell 等，1995）。在质粒中，四个IPP分子被压缩成一个GGPP分子。然后，两个GGPP分子可以由八氢番茄红素合成酶1（PSY1）催化形成无色的15-顺式八氢番茄红素分子，去头浓缩，导致zeta;-胡萝卜素和粉红色番茄红素的生成。然后通过类胡萝卜素异构酶（CRTISO）将原番茄红素转化为全反式番茄红素。接下来，LCY-B和LCY-E分别催化番茄红素环化产生beta;-胡萝卜素或alpha;-胡萝卜素。这些物质可以分解成叶黄素、玉米黄质和其他类胡萝卜素。番茄红素是成熟番茄中类胡萝卜素的主要成分，具有诱人的色泽。因此，增强番茄红素在番茄中的积累有助于改善番茄的颜色和功能特性。

调节番茄红素代谢途径中关键基因的表达是增加番茄红素含量的有效方法。最近，植物基因组修饰取得了重大进展（Giuliano等，1993；Fraser 等，1994，1999；Rosati等，2000；Galpaz 等，2008；Chen 等，2015）。例如，转基因植物中番茄红素，如环化酶2（LCY-B2）的无效突变使番茄红素含量平均增加约5％，并形成深红色番茄果实（Ronen等，2000）。此外，八氢番茄红素合成酶1基因的超表达(PSY1)显著增加番茄果实中番茄红素的水（Fraser 等，2007）。果实特异性干扰RNA作用，抑制9-环氧类胡萝卜素二氧合酶1（NCED1）产生了深红色的果实，番茄红素和beta;-胡萝卜素的积累很高（Sun等，2012）。此外，沉默的“绿色1”（SGR1）通过果实成熟过程中的生理作用，显著提高了果实中番茄红素和beta;-胡萝卜素（分别为4倍和9倍）的积累（Luo等，2013）。然而，最近通过调节类胡萝卜素代谢途径来增强番茄果实中番茄红素积累的研究主要集中在单个相关基因的修饰上。由于代谢机制的复杂性和完整性，通过调控多个基因来实现番茄红素的积累的报道还很少。因此，在本研究中，CRISPR / Cas9用于调节番茄类胡萝卜素代谢途径相关的多个基因，以增加果实中的番茄红素含量，并探索特定关键基因在类胡萝卜素代谢中的作用。一方面，我们为CRISPR / Cas9多重基因组编辑在代谢途径中的应用奠定了基础，另一方面，我们提供了一种新的研究思路，用于设计代谢途径中某些目标物质的含量。

材料和方法

植物材料和生长条件

本研究以茄属植物番茄野生型AC为材料。所有的植物都生长在同一个温室(温室条件：16小时光/8小时暗，25℃）。采集果实成熟期后7天（Br 7）的组织样本，立即冷冻在液氮中，保存于-80℃。成熟的种子在T0植株上采集并干燥，在25℃摇瓶中摇匀。然后将发芽的种子种在土壤中，并在上述培养条件下培育幼苗。

图1 |目标基因的选择和CRISPR/Cas双表达盒的设计。

  1. 类胡萝卜素代谢途径的靶基因图谱。绿色方框代表了代谢途径中的关键物质。红色和橙色框显示两种物质分别为番茄红素和beta;-胡萝卜素。实线箭头表示直接效果，虚线箭头表示间接效果。所选择的目标基因用紫色方框表示，红色星号代表目标基因作用于该途径的位点。G3P：三磷酸甘油醛；DXS：1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸核酶；GGPPS：香叶基香叶基焦磷酸合酶；PDS：八氢番茄红素脱氢酶；ZISO：Z-胡萝卜素异构酶。
  2. 根据番茄红素的合成和代谢途径选择5个靶基因，设计6个靶位点。目标序列用红色和小矩形框标记，表明PAM，直线和方框分别是目标基因的内含子和外显子。

(C) （C）pYLCRISPR / Cas9-番茄红素二元载体的结构。HPT(H)编码潮霉素B磷转酶。设计的6个目标用不同颜色的实心盒子表示，并用于每个目标的启动子。

sgRNA目标序列的选择和pYLCRISPR/cas9-番茄红素载体构建

CRISPR-P用于选择靶向SGR1的特异性sgRNA(基因库登录号DQ100158)，番茄红素环化酶（LCY-E；基因库登录号EU533951），beta;U番茄红素环化酶（Blc；基因库登录号,XM_010313794），beta;-番茄红素环化酶1（LCY-B1;基因库登录号;EF650013）和LCY-B2（基因库登录号，AF254793）（补充表S1）。不适当的GC含量会导致低效的编辑（Wang等，2014)；因此，GC的含量应介于55% ~ 75%之间。

此外，在目标序列中要避免了4个或更多个连续的T核苷酸，因为它们会被RNA聚合酶III识别为转录终止信号。此外，由于sgRNA的二级结构受编辑效率的影响，因此采用RNA折叠程序确保目标序列与sgRNA序列之间的碱基对不超过5对（Makarova 等，2011)。为了获得对基因功能更明显的影响，所以选择了非目标基因较少的靶点。

pYLCRISPR/ cas9番茄红素载体构建如前面所述（Ma 等，2015）。 首先，在第一个PCR过程中，每个目标序列都被配到相应的sgRNA表达盒中。随后进行第二次PCR，诱导靶区内的BsaI酶切位点，生成具有目标序列的sgRNA表达盒。PCR标准条件为：94℃ 2分钟；94℃ 10秒，55℃ 30秒，68℃ 20秒（28个循环）；72℃ 7分钟。最后，利用金门连接对pYLCRISPR/Cas9番茄红素载体中的6个sgRNA表达盒进行一轮克隆，将sgRNA表达盒组装成pYLCRISPR/Cas9二元质粒。孵育三个周期（37℃ 10分钟；10℃ 分钟；20℃分钟），随后进行10个周期（37℃ 3分钟；10℃ 分钟）反应物在37℃孵育5分钟。

植物转化

采用农杆菌介导的转化方法（Van Eck 等，2006），将含有pYLCRISPR/ cas9 番茄红素质粒的农杆菌转化AC。用4% NaClO灭菌后，在MS培养基上萌发番茄种子。培养后7-10天后，用OD600 = 0.5~0.6农杆菌悬浮液侵染下胚轴的顶端。然后，将外植体接种在含有潮霉素(10micro;g/ml)的选择性平板上，直到从愈伤组织处再生转基因植物。体外再生后，将植物移植到光生长室中的土壤中。

DNA提取和突变检测

取大约1-5㎎的新鲜冷冻叶，使用hi-DNA安全植物试剂盒（Tiangen, Beijing, China）用于DNA提取。然后用已提取的基因组DNA作为模板，利用位于目标位点侧面的引物（补充表S3）对每个目标基因的相关片段进行扩增。标准PCR条件如下：94℃ 3分钟；94℃ 30秒；55℃ 30秒；72℃30秒，（35个循环)和72℃ 7分钟。PCR产物通过内部对引物进行直接测序(补充表S3)或克隆到peas- t1 （TransGen Biotech, China）载体上，然后使用Sanger方法测序，识别突变。利用DSDecode3对双等位基因突变和杂合突变产生的重叠序列色谱进行解码。对每个靶标的突变率进行计算，每个目标上被编辑的转基因番茄植株的数量是24（获得的转基因番茄植株总数）。

Cas9和脱靶分析

从番茄红素突变体中随机选取10个突变体进行PCR，检测Cas9基因。PCR标准条件如下：94℃ 3分钟；94℃ 30秒；55℃ 30秒；72℃ 30秒(35个循环)和72℃ 7分钟。用于扩增Cas9基因的引物列于补充表S6中。

用在线工具（crisprs - p）预测的靶点，从目标编辑的植株中选择相应的株系，对PCR扩增片段中相应基因位点的变化进行测序。标准PCR条件与Cas9分析相同，用于脱靶位点突变分析的引物列于补充表S4中。

类胡萝卜素的提取和RT-HPLC分析

将样品置于液氮中冷冻并制备成粉末，测定类胡萝卜素含量。将约0.2~0.5g组织粉末溶解于1ml丙酮中，离心。将组织碎片溶解于1ml二氯甲烷中并离心。将丙酮滤液与上清液混匀。重复溶解并收集溶剂，直到组织失去颜色。将溶剂混合物与同等体积的乙醚和0.2体积的12% w/v NaCl/H2O进行分离，提取出有色物质。收集有颜色的有机部分（上层相）并在N 2气流下干燥，将干燥的脂质提取物重新溶解在1mL丙酮中用于进一步分析。

使用反相高效液相色谱（RT-HPLC）分析类胡萝卜素，如先前研究中所述，进行一些修改（Neuman 等，2014）。用一种稳定的液相色谱系统进行色谱分析（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, United States）配备G1322A型脱气器、G1311A型输液泵、G13131313A型自动采样器、G1316A型柱式热固器、G1314A型探测器。

固定相包括Diamonsil C18（2）反相柱（4.6毫米times;250毫米,5micro;m；Dikma）。流动相由洗脱液A（乙腈：H2O，v/v；9：1）和洗脱液B（乙酸乙酯）组成，流速恒定为1 mL /

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