二硫键对甲羟戊酸激酶的影响外文翻译资料

 2023-01-06 11:15:33

二硫键对甲羟戊酸激酶的影响

原文作者 Xiusheng Chu, and Wenhua Yu

摘要：甲羟戊酸激酶是在甲羟戊酸途径的ATP依赖性酶之一，催化甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。在动物细胞中，它起着调节胆固醇生物合成的关键作用，而在微生物和植物中，它参与异戊二烯衍生物的生物合成，而异戊二烯衍生物是天然产品的最大群体之一。在它的晶体结构和顺序中，有一个独特的二硫键存在于热物种-詹氏甲烷球菌的甲羟戊酸激酶，但不是在大鼠对准显示甲羟戊酸激酶。我们研究了二硫键的效果，分析詹氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶和一种工程酶，通过它们的野生型和变体的表征，研究二硫键在酶的性质，这种工程酶为大鼠甲羟戊酸激酶突变体A141C酶。我们的结果表明，半胱氨酸107和半胱氨酸281二硫键是维持构象和热活性重要的因素之一。M.球菌甲羟戊酸激酶中其他交互也可能影响构象和热稳定性。硫醇滴定法和荧光实验法进一步表明该鼠甲羟戊酸激酶A141C变体酶有一个新的二硫键，这使得该变体蛋白提高其热稳定性和抗蚀尿素变性。

关键词: 甲羟戊酸激酶、二硫键、影响因素、热稳定性、硫醇滴定、荧光实验

1.引言

目前，异戊烯焦磷酸（IPP）的共同异戊二烯生物合成前体，主要通过两个产生代谢途径。一个是甲羟戊酸途径，另一个是2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径。甲羟戊酸途径被假定为胞质，MEP途径已经显示在细胞内叶绿体。之前有实验表明，甲羟戊酸途径以任何一个直接或间接的方式,在萜吲哚生物碱的生物合成中发挥了至关重要的作用。甲羟戊酸激酶是连续三个ATP依赖的一个酶，在甲羟戊酸途径和催化甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。

在微生物和植物中，甲羟戊酸激酶参与类异戊二烯衍生物的生物合成，其中有一个最大的天然产物的基团。目前，有3万多天然存在的萜烯和萜类化合物已被描述。萜类化合物具有多种生物活性，应用于许多有潜力的药用，例如beta;胡萝卜素，紫杉醇，和维生素A。在动物细胞中，实验已经表明胞质中甲羟戊酸激酶在胆固醇生物合成途径中，起着重要的调节作用。它参与胆固醇生物合成的酶定位，像各种抑制剂用于治疗胆固醇相关的疾病，例如心血管疾病。甲羟戊酸激酶的意义已经被进一步凸显在人类遗传性疾病的酶的含义，例如免疫学和高免疫球蛋白血症D /周期性发热综合征（HIDS）。此外，甲羟戊酸激酶参与激素生物合成的同时，针对甲羟戊酸激酶失活已发展为一个病虫害防治方法。从各种来源的甲羟戊酸激酶通常由二聚结构相同的亚基组成，酶的分子量而变化，从70到105 kDa。从大鼠的甲羟戊酸激酶的晶体结构来看，詹氏甲烷球菌、肺炎链球菌已确定。虽然来自三个不同来源的酶具有相似的总体结构折叠，M.球菌甲羟戊酸激酶表明Cys107和Cys281形成二硫键，而大鼠和肺炎链球菌甲羟戊酸的结构激酶指示没有存在这样的二硫键。通过甲羟戊酸激酶序列比对，从各种来源进一步表示该半胱氨酸残基形成M的二硫键。M.詹氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶存在于主题II和主题III，而残留107M处.球菌甲羟戊酸激酶是主题II的唯一半胱氨酸。我们通过它们的野生型表征的酶和变体酶调查了二硫键的效果。M.球菌甲羟戊酸激酶和二硫键在大鼠甲羟戊酸激酶突变体A141C上发挥作用。

2.材料和方法

2.1 材料

螯合的HiTrap金属亲和柱从Amersham公司购买

法玛西亚生物技术：乳酸脱氢酶，丙酮酸激酶，磷酸烯醇丙酮酸，NADH，（RS）—mevalonic酸内酯，和ATP购自西格玛。

Taq DNA聚合酶，HB101感受态细胞，大肠杆菌菌株，BL21（DE3）感受态细胞，和琼脂糖来自Invitrogen。

得到的质粒Mini试剂和合成的寡核苷酸来自香港科技飞龙公司。

凝胶提取试剂盒和限制酶来自德国的MBI Fermentas公司。

所有其它试剂均为从商业渠道获得。

如前所述得到詹氏甲烷球菌和大鼠甲羟戊酸激酶。

2.2 M.球菌甲羟戊酸激酶突变体C107S的建设。C281S，C107A，C281A和和双突变体C107S/ C281S和C107A/ C281A。

大鼠甲羟戊酸激酶突变体A141C，一个公司的QuikChange诱变试剂盒（Stratagene）应用于构建在pMMK（C107S），mMMK（C281S），mMMK（C107S/ C281S），mMMK（C107A），pMMK（C281A），pMMK（C107A/ C281A），和pRMK（A141C）突变体表达质粒。质粒pLM1:: MMK用作模板用于构造pMMK（C107S），pMMK（C281S），pMMK（C107A），和通过PCR反应pMMK（C281A）表达质粒。该pMMK（C107S）的表达质粒作为模板用于构成双突变pMMK（C107S/ C281S）表达质粒。该pMMK（C107A）表达质粒用作模板用于构建双突变pMMK（C107A/ C281A）表达质粒。质粒pLM1:: RMK含有全长鼠甲羟戊酸激酶的基因被用作模板通过PCR反应，构建pRMK（A141C）质粒。下列引物和反义的引物合成引入突变序列。所有构建体和突变通过与使用特异性寡核苷酸的染料终止循环测序试剂盒进行测序确认。

2.3表达和M.球菌和大鼠甲羟戊酸的净化激酶野生型和变体酶。按照已建立的方法来制备样品。

布拉德福德的方法用于测定蛋白质含量用牛血清白蛋白作为标准。洗脱的分级通过SDS-PAGE以分析的Laemmli的不连续缓冲液。凝胶采用考马斯染色马斯亮蓝R-250。

2.4测定M.球菌和大鼠KM和Vmax值

甲羟戊酸激酶野生型和变体酶为甲羟戊酸激酶的知识管理和决心Vmax值是使用基于先前描述的以下测定方法进行。具有不同的底物浓度。 0.1标准储备液中号（RS）-mevalonic酸：是通过将65毫克的结晶状甲羟戊酸激酶的酸内酯加入到3毫升的0.2N KOH中。将该溶液在37℃下加热1小时，促进水解内酯。将溶液的pH调节至7.2，用0.1N盐酸，加入5毫升水。以下成分是：0.1M KH2PO4/K2HPO4缓冲液，pH 7.5，0.16毫：在1.0毫升比色杯中培养NADH，5mM的氯化镁，4毫摩尔ATP，3mM的（RS）-mevalonic酸，0.5毫磷酸烯醇丙酮酸，81单位丙酮酸激酶，和75个单位的乳酸脱氢酶。酶活性的测定是在34℃的进行。实验中使用的是日立U-2001年紫外/可见双光束光谱仪。 NADH的背景速率氧化，测定2分钟，然后加入甲羟戊酸激酶。该反应物经过另外2分钟监测。酶活性的一个单位被定义为活动的量所需的生产1微摩尔的甲羟戊酸的每分钟-5-磷酸。

2.5圆二色性（CD）光谱法

光盘光谱是使用日本分光Ĵ810分光，在25℃下进行。Bradford的方法用于确定该蛋白内容，用牛血清白蛋白作为标准，取平均值用于蛋白质浓度的测定。该蛋白质的远紫外光谱，从200测量到250nm中20mM磷酸钾缓冲液，5mM的beta;巯基乙醇和5％甘油，pH为7.5，用下面的仪器设置：响应1秒，速度50纳米/分钟，平均4s扫描，和路径长度为1毫米。蛋白质浓度为0.30毫克/毫升和对数据进行相减处理缓冲区的频谱。

2.6由DTDP方法蛋白巯基的测定

使用试剂蛋白巯基的测定4,4-二硫（DTDP）的基础上与前面描述进行。M.球菌和大鼠甲羟戊酸激酶野生型和突变型蛋白样品进行透析广泛在之前4℃针对50mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）测量以除去beta;巯基乙醇。蛋白质样品调整为1毫升的最终体积和更小的最终巯基浓度大于40mu;m由稀释用缓冲液。加入50微升4毫DTDP的后试剂，样品立即涡旋，并读取A324针对水空白（1毫升光路）后在室温下孵育5分钟的数值。采取试剂空白（A324r），1毫升50mM磷酸钾缓冲液（pH 8.0）中为混合50微升4毫米DTDP试剂。在该蛋白质空白（A324p）下，将1毫升蛋白质样品用50微升水混合。在含自由巯基的1毫升蛋白质样品根据使用下面的公式计算标准值ε324=21,400 M-1cm-1mol SH =0.00105L*（A324s-A324r-A324p），变性的蛋白质的巯基的测定进行了按照相同的程序，将蛋白质用4M预处理尿素，完全展开它们。

2.7热计量活动

M.詹氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶野生型和变异蛋白样品在83℃温育10分钟，而大鼠甲羟戊酸激酶野生型和突变蛋白质样品在不同温度下温育10分钟。温育后，如所述蛋白质样品进行测定的酶活性。

2.8大鼠甲羟戊酸激酶野生型和A141C变体酶的荧光光谱

以下对荧光光谱进行了描述与稍作修改。鼠甲羟戊酸激酶野生型或A141C变体在0.2毫升溶液酶（20微克）用于荧光光谱测量。酶在20mM磷酸缓冲液减少（pH7.5）中含有5mM DTT，在37℃1小时在黑暗中进行进一步荧光光谱测量。荧光光谱是在的蛋白质浓度与溶液1毫升体积中进行在室温下用20微克/毫升在50mM的Tris-HCl缓冲液（pH7.5）FluoroMax-3（Yvon公司-SPEX，格拉斯布伦，德国）以激发波长在278纳米。发射光谱扫描从295至520纳米。狭缝宽度为用于激发和发射8纳米。发射光谱没有DTT蛋白质减少或降低蛋白质被记录相同的激发波长和蛋白质浓度。

2.9 M.詹氏甲烷球菌和大鼠甲羟戊酸激酶的TNP-ATP结合试验野生型和变体酶

下面公布的方法，在一些变型中，野生型和变体酶的ATP结合位点的结构完整性使用荧光探针TNP-ATP的ATP类似物进行了研究。M.球菌甲羟戊酸激酶（180微克，4.86mu;M）或大鼠甲羟戊酸激酶（180微克，4.14微米）在10mM的Tris-HCl，10毫氯化镁，在pH8.0进行滴定与TNP-ATP和相同的缓冲液缺少酶被用来在控制实验。在这些实验中使用的激发波长为408纳米。发射光谱扫描从500至650纳米，用5纳米狭缝宽度。在数据分析，值里面结合探针的荧光发射通过测量的詹氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶545-551纳米，对大鼠542-546纳米甲羟戊酸激酶用无TNP-ATP /缓冲与任何更正散射发生。这些修正的荧光增强数据分别为用来算TNP-ATP浓度和非线性分析回归产生的解离常数（KD）和最大的推断荧光强度（最大频率）。

2.10 M.詹氏甲烷球菌和大鼠的剩余活性的测定

甲羟戊酸激酶野生型和变体酶变性由尿素激酶野生型和变体酶在4M尿素中温育，而M詹氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶野生型和变体酶在8M尿素不同的时间孵育。

3.结果与讨论

3.1 突变质粒，表达与作用

变体酶的提纯：一个公司的QuikChange诱变试剂盒（Stratagene）的申请构建pMMK（C107S），mMMK（C281S），mMMK（C107S/ C281S），mMMK（C107A），pMMK（C281A），pMMK（C107A/ C281A），和pRMK（A141C）突变体的表达质粒。新构造的突变质粒的序列进行了验证的定向突变的存在与没有通过DNA的PCR产生的随机突变测序。功能M.球菌和大鼠的表达：甲羟戊酸激酶野生型和变体酶的SDS-PAGE用的N95％纯度，其中一个34-kDa带验证观察詹氏甲烷球菌甲羟戊酸激酶野生型和变体酶，而观察到大鼠甲羟戊酸激酶野生型和变体的42 kDa带酶。镍金属亲和树脂柱为用于单步纯化His标记M.詹氏甲烷球菌和大鼠甲羟戊酸激酶野生型和变体酶。该洗脱的蛋白分级，透析50毫磷酸钾缓冲液，pH8.0尽快后的纯化。所有M.球菌和大鼠甲羟戊酸激酶野生型和变体的酶，得到为可以储存在-80℃下至少6个月没有可溶性蛋白活性显著损失。

3.2 M.球菌的动力学研究和大鼠甲羟戊酸激酶野生型和变体酶

詹氏甲烷球菌和大鼠的动力学鉴定甲羟戊酸激酶野生型和变体的酶，分别为五底物浓度测量在34℃和平均数两种测定法用于每个点。动力学的结果研究总结表示，和动力学参数通过使用SIGMAPLOT 8.0非线性曲线拟合得到程序。据报道，M。詹氏甲烷球菌和鼠甲羟戊酸激酶使用类似的催化反应机制，这是与本结果是一致的对于野生型酶的Km和Vmax值是相似的对彼此。基于詹氏甲烷球菌的晶体结构甲羟戊酸激酶，Cys107和Cys281形成二硫键可稳定推定的构象磷酸结合环。所有Cys107的动力学参数和Cys281突变为M.球菌甲羟戊酸激酶具有不同于野生型酶，温和的不利变化作为降低V最大值和增加的KM值ATP的，表明该二硫键是重要稳定的构象的推定的磷酸结合M的环球菌甲羟戊酸激酶。这可能是其他因素，例如氢键，盐桥，和疏水相互作用，也向构推定的磷酸结合环的稳定性。动力学大鼠甲羟戊酸激酶突变体A141C的研究结果显示，该引入新的二硫键，这被证明是的由DTDP滴定实验，形成了突变体A141C表2中所示，也可导致一些轻微的不利变化其动力学参数，如降低的Vmax值和为甲羟戊酸的增加KM值，这表明引入二硫键可能就一些影响酶的构象。

从各种来源的甲羟戊酸激酶的序列。LH：瑞士乳杆菌; SG：链griseolosporeus; SPN：肺炎链球菌;间谍：化脓性链球菌; EF：肠球菌;上海：溶血葡萄球菌; RN：褐家鼠; MM：小家鼠; HS：智人; HB：巴西橡胶树;在：拟南芥; MJ：甲烷球菌。残留不保守在但是在一些序列保守的所有序列都标有。ClustalW进行序列比对，制成3.3 M.詹氏甲烷球菌和大鼠甲羟戊酸的结构分析激酶野生型和变体酶与CD谱图，在光盘光谱中的紫外区（200-250纳米）下对M.球菌的二级结构鼠甲羟戊酸激酶野生型和变体酶进行测定。该所有的变体酶的远紫外光谱，那些对应的野生型酶的，这表明这

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