金线莲标准化的水提物调制小鼠气道高反应的模型外文翻译资料

 2023-01-06 11:16:16

金线莲标准化的水提物调制小鼠气道高反应的模型

C.-C. Hsieha, H.-B. Hsiao b, W.-C. Linc

a 动物科学与生物技术、东海大学,台中,台湾

b 生命科学部门,国立中兴大学,台中,台湾

c 医学院药理学系,中国医科大学,施松林路91号、40402台中,台湾

关键词：金线莲、气道高反应、调节性、Th1/Th2

摘要：

金线莲，一种中药，是民间用于治疗发烧、疼痛、肺、肝疾病的药。过敏性哮喘的特征是增加血清IgE水平和气道的炎症，伴随着高水平的白介素(IL)4和IL-5支气管肺泡灌洗液体(BALF)。气道平滑肌收缩和(AHR)气道高反应的发展是最重要的过敏性气喘症状。在我们之前的研究中,一个标准化的金线莲（SAEAF）的水提物被用来调节正常老鼠的先天免疫。在这项研究中，气道炎症的渗透,包括T细胞分化、细胞因子调制、过敏抗体估计,肺部病理学、气道高反应性和AHR的增强间歇(金边)被用来评估SAEAF治疗一个卵清蛋白(OVA)吸入呼吸道过敏小鼠模型。由此产生的细胞因子概况证SAEAF管理卵清蛋白吸入后可以显著降低Th2极化。这些结果还表明,SAEAF调节细胞因子分泌在过敏性哮喘。调制自然T调节细胞(CD4 CD25 / Treg)也在过敏性肺部炎症和嗜酸性粒细胞和巨噬细胞进一步抑制气道炎症浸润中显示增加免疫抑制。最后,减少气道anti-OVA IgE分泌和观察气道高反应性的降低。我们的结果表明,SAEAF管理可以调节细胞因子和T细胞亚群的调节炎症细胞浸润和调制过敏反应。

引言：

家庭兰科是台湾最重要的农业资源。金线莲在台湾民间医药市场由于其多样的药理作用是非常宝贵的。先前的研究,包括我们,表明不同的提取的甲醛聚糖对抗高血糖(Shih et al .,2002),抗骨质疏松症(Shih et al .,2001),抗肥胖症(Du et al .,2003),抗疲劳(Ikeuchi et al .,2005),和保肝(方舟子et al .,2008;吴et al .,2007;Shihet,2005)有影响。曾et al。(2006)表明,热水提取金线莲能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性,但其活性成分和机制仍不完全清楚。

过敏性哮喘的特征是增加血清IgE抗体水平和气道炎症水平较高的白介素(IL)4、IL-5支气管肺泡灌洗液体(BALF)以及呼吸道粘膜(吉尔摩和薰衣草,2008;马特斯和培育,2003)。T调节细胞亚群已被证明控制过敏性气道炎症的疾病(Jutel et al .,2006;麦基和Agrawal,2006;Romagnani,2006)。气管平滑肌的收缩和发展(AHR)气道高反应的反应是最重要的支气管哮喘气道狭窄的表现(Berend et al .,2008;穆尔et al .,2008;Cockcroft和戴维斯,2006)。

在目前的研究中,一个标准化的金线莲水提物没有准备的乙酸乙酯部分证明提取的行为可以治疗支气管哮喘。SAEAF在老鼠的体内效应调查通过检查生产有浓度过敏原特异性IgE抗体,Th1 / Th2细胞因子,Treg调制,使用一个气道高反应性和增强间歇(金边)的卵清蛋白(OVA)致敏气道过敏小鼠模型。

材料与方法

saeaf的制备

金线莲从Innorchid购买农业生态学——真正的生物技术有限公司(Pu-Li、台湾),由中国医药科学研究所，

中国医科大学(植物标本数量:CMCP1253)。

新鲜,整个植物的培养。金线莲用水提取,用乙酸乙酯分区。水分进一步过滤和蒸发减压下产生紫色的残渣,收益率约为2%。一个标准化的水提物的SAEAF准备。金线莲苷是由高压液相色谱法(HPLC),在同等条件下,建立在我们之前的研究之上(吴等等。,2007)。使用rHPLC的条件如下:泵,日本岛津公司LC-10ATvp;示差折光检测器,日本岛津公司RID-10A;列,Mightysil ODSRP-18GP Aqua(i.d.4.6mu;m 250 mu;mlong列），雄性BALB / cmice重18 - 22 g都是从国家实验动物中心(台湾)获得的。他们年龄在6到8周时就开始试验。动物们被安置在笼子里，通风微隔离器系统(vmi)保持在21℃12 ~ 12℃和12h的光周期。动物被喂养以标准的无菌啮齿动物食物的饮食(TestDiet 5010)和蒸馏水。

卵白蛋白致敏和挑战

在老鼠敏化的腹腔内注射0.1 ml / 10 g的老鼠卵子(gradeV Sigma-Aldrich,圣地亚哥,美国)吸收氢氧化铝凝胶(AHG;Sigma-Aldrich,圣地亚哥,美国)在盐水车(0.5 mgovawith2mg AHG /公斤ofmice)。10天后,老鼠吸抗原入鼻内五次(每天一次)，接种75毫升的卵子(2.0毫克/毫升)11天到15天。经过一个星期的休息,老鼠从气道中恢复(从第16天到22天)。进一步SAEAF治疗一周(0.5 以及1.0g /公斤)和控制与蒸馏水23日至29日,每天的小鼠卵子暴露吸入挑战30天。老鼠在吸入卵细胞之后挑战监测肺浸润的免疫调节作用。该组小鼠以未经处理的小鼠作为参考条件。

无创测量气压的气道反应全身体积描记法(WBP)

在卵细胞吸入之后小鼠气道反应性的表达增强的间歇(金边)作为参数改变气道功能使用MAX II 1320模块化单元(美国纽约Buxco,特洛伊)。

老鼠被短暂地放置在动物体积描记器室,这个室之间的压力差和主燃烧室的参考室积分(称为箱压力信号)测量和记录使用压差传感器连接到放大器。

盒子体积和合成压力造成的压力信号的变化随着小鼠的呼吸循环而变化。气道阻力是一个无量纲值表示的函数，是最大呼气和最大吸气箱压力信号和过期的时机的比例。根据制造商的说明,气道阻力被定义为 (Te-Tr)/ Tr(PEP / PIP)Te呼气时间(秒);Tr是弛豫时间(秒),定义为总数的30%的压力衰减的时间呼气压力信号(盒子面积压力信号在到期日);PEP是呼气压力峰值(毫升/秒);和脉冲峰值spiratory压力(毫升/秒)。气道阻力的波形的变化反映了盒子在吸气和呼气压力信号,并将这些变化与早期和晚期过期的时间比较。每个实验测量气道阻力的时间为2分钟。

支气管肺泡灌洗液(BALF)收获和肺浸润决定性

卵子的挑战后,小鼠的肺与戊巴比妥麻醉在(1.5 g / kg)的比例下,气管插管,1.0毫升无热源的生理盐水被灌输进肺部。气管插管夹紧,在BALF恢复之前之前按摩15到30秒。一毫升生理盐水灌输进入肺部,并接受了手术治疗三次.收货BALF(3.0毫升)和进一步在300 g 10分钟4℃离心。获得的细胞球,离心后进行涂片细胞计数，并用刘的方法进行染色。最低500细胞涂片的计算使用光学显微镜并且分为淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞根据标准形态的标准。每个细胞所占的的比例取决于所有的细胞。

BALF中卵清蛋白特异性的IgE

BALF被添加复制到酶联免疫吸附剂测定(ELISA)板涂有卵子(20毫克/毫升in0.05M碳酸缓冲,pH9.5)。

孵化后在4℃的温度下放一晚上,盘子洗和孵化HRP-共轭山羊小鼠的多克隆IgE(Bethyl实验室公司，美国蒙哥马利,TX)1 h,其次是洗液和发展SureBlue储备TMB Microwell过氧化物酶底物(Kirke-gaard佩里实验室、盖瑟斯堡,医学博士,美国)。样品的吸光度在450nm。

卵清蛋白特异性IgE BALF中浓度与吸光度(A)计算。

Units are presented as ELISA Units(EU), calculated as follows:

EU单位作为ELISA单位(欧盟),计算如下:

EU=(Asample-Ablank)/(Apositive-Ablank)

T细胞亚群的BALF评价

BALF细胞由表面标记的检测测定特异性结合的单克隆抗体(mAb)推荐的正欲单克隆中心所决定。(FACScan BD生物科学,山景城,美国)。

简单地说,50毫升的细胞悬液(5times;10细胞)孵化的饱和浓度荧光素,藻红蛋白或PE-Cy5共轭马伯(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)于冰上在黑暗中放置30分钟。细胞被杜尔贝科改进的含有0.1%叠氮化钠以及1amp;FBS的磷酸缓冲盐(DPBS)冲洗。Cytofluorometric分析表现在淋巴细胞数侧向散射(SCC)和向前散射散射(FSC)，并在在488 nm处激发激光。白细胞数量由1times;104个细胞决定。计算机系统(CellQuest BD生物科学)是用于数据采集和分析。1times;104个细胞的列表模式数据已储存。在百分比计算的基础上,发现淋巴细胞的数量存在于每个象限。T细胞表面标记测定rCD3(克隆145 - 2 - c11)/ CD45(克隆30-F11),辅助T细胞(Th)通过CD3 / CD4(cloneRM4-5),T细胞毒性细胞CD3 / CD8(clone53 - 6.7),和自然 CD4 / CD25(克隆PC61)。

评估BULF的组成研究SAEAF在BALF细胞因子在卵子受影响的老鼠中的影响,一个双倍-抗体夹心ELISA进行根据制造商的建议(美国e生物科学圣地亚哥,CA)而完成。IL-2、IL - 4、IL - 12、IFN-g 以及肿瘤坏死因子-a从e生物科学购买(ELISA Ready-SET-Go ! 圣地亚哥,起见)。捕获抗体被添加到96孔板,然后于4℃孵化一夜。每个样品冲洗三次之后，于室温下放置60分钟，再洗三次标准和样品的以1:20的比例被添加到孔中。在室温条件下孵化2小时,在孔内洗五次,添加检测抗体,然后洗七次。底物溶液(四甲基联苯胺)被添加到每个在黑暗中孵化后的孔内,然后停止解决终止酶活性。吸光度测量与参考值分别在450nm和570nm，(酶光谱,热电子公司,圣何塞,CA,美国)。

组织病理学检查

为了肺组织病理学检查,小鼠牺牲,并且作为标本嵌入石蜡。5mu;m的截面在自来水冲洗5到10分钟前被准备好并且浸在埃利希的苏木精中5分钟随后在含有1%盐酸的70%酒精中用自来水滴3-5秒然后再用自来水洗5到10分钟。玻片蘸1%伊红染5分钟,然后放在自来水直到细胞核出现蓝色。这些切片再次连续集中地用70%、80%、90%和100%的酒精连续脱水。染色后,准备好的每只小鼠的肺组织分段横向通过中部肺细支气管和细支气管分支。因此,这些切片是每只小鼠的组织学检验。

统计分析

结果表示为平均plusmn;标准差。单向方差分析用于多个组比较,在邓肯的测试用于事后检查。差异为P lt; 0.05被认为是显著的。

结果

金线莲苷高效液相色谱仪定量测定

金线莲苷的线性关系和AUC标准计算解决方案和图1所示。金线莲苷被认为使用高效液相色谱法和RI探测器得保留时间为12.2分钟(图1A).从我们的研究结果表明,SAEAF的三个分析物的量是180毫克/克(如图1B).金线莲苷的结构如图1 c所示。

Fig. 1.图1所示。SAWAF的金线莲苷成分定量测量使用高效液相色谱检测器。注意, 金线莲苷识别峰的保留时间12.2分钟

标准(A),SAEAF模式的高效液相色谱法(B)的结构和金线莲苷的结构(C)。

卵清蛋白吸入过敏小鼠内SAEAF对BALF中细胞分布的影响。

没有可观察到的异常的临床症状归因于SAEAF剂量,并没有失去体重,也没有肥胖或畸形。

卵清蛋白吸入过敏小鼠的肺泡灌洗液细胞分布的变化在1、6、12、24、48和72 小时与不同剂量治疗后的SAEAF如表1所示。鼻内吸入75毫升的卵清蛋白(2.0毫克/毫升)的敏化没有SAEAF治疗(控制)诱导的小鼠的数量显著诱发渗透BALF中细胞以及嗜酸性粒细胞(表1)在一小时后数量的增加。渗透到细胞的水平在12 h达到顶峰,然后逐渐返回72 h。为评估预防性SAEAF对过敏原的影响
诱导气道炎症,SAEAF治疗嗜酸性粒细胞浸润分别减少了24小时(SAEAF,0.5克/公斤)和12 h(SAEAF,1.0克/公斤)。此外,在24小时以后淋巴细胞显示显著增加。

流式细胞术分析BALF致敏小鼠t细胞数量

SAEAF的效应t细胞亚群的变化百分比是由与免疫荧光流式细胞术CD3单克隆抗体直接染色、CD4、CD8 CD25和CD45分子渗透BALF中淋巴细胞挑战老鼠(表二)决定的。对照组小鼠在48小时之后显著减少自然细胞表明后期的哮喘反应的免疫过度状态调节。我们发现增加的百分比自然亚群的子集(CD4 CD25 )在48 h后会显示出哮喘反应的免疫抑制状态。

SAEAF卵清蛋白吸入过敏老鼠BALF细胞因子和IgE渗透的结果

BALF细胞因子渗入显示SAEAF管理之后il - 4的表达下降并且增加SAEAF(1.0 g / kg)管理IFN-g和IL-12at的剂量。Th1极化环境和进一步减少炎症性肠病和肿瘤坏死因子-a在SAEAF管理中的表达post-OVA也是同样的显示(表3)。Anti-OVA 免疫球蛋白E在 SAEAF管理下也显著降低(P lt; 0.05)0.5g /公斤,P lt; 0.01,1.0克/公斤;图2)

SAEAF对OVA诱发呼吸阻力的影响

增强间歇(金边)在雾化吸入OVA后1、6和24小时被检测到(图3)。卵清蛋白吸入过敏小鼠在1-6个小时明显的直接诱发支气管收缩。在立即响应之后,晚期支气管狭窄在24小时之后观察得到。

Further bronchoconstriction can

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