纳米银颗粒可诱导黑腹果蝇热休克蛋白70、氧化应激和细胞凋亡外文翻译资料

 2023-01-07 10:39:23

纳米银颗粒可诱导黑腹果蝇热休克蛋白70、氧化应激和细胞凋亡

Maqusood Ahamed, Ryan Posgai , Timothy J. Gorey , Mark Nielsen , Saber M. Hussain , John J. Rowe

关键词：银纳米粒子 Hsp 70 氧化应激 DNA损伤 细胞凋亡

摘要：由于银纳米颗粒(Ag NPs)的广泛商业应用，对其进行风险评估纳米粒子非常重要。我们之前的体外研究表明Ag NPs引起小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞的DNA损伤和凋亡。然而，Ag NPs的体内毒性是很大程度上缺乏。本研究是为了检验具有良好特性的多糖的毒性作用，涂布10nm Ag NPs对黑腹果蝇热休克应激、氧化应激、DNA损伤和细胞凋亡的影响。以标准玉米粉培养基混合饲料喂养黑腹果蝇三龄幼虫Ag NPs在50和100mu;g /ml的浓度24和48 h。Ag NPs上调的热休克蛋白70的表达与黑腹果蝇的氧化应激有关。丙二醛水平，脂质过氧化终产物显著升高，抗氧化剂谷胱甘肽含量显著升高Ag NPs暴露的生物体中较低。暴露于Ag NPs的生物体中抗氧化酶，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性也显著升高。此外，Ag NPs上调细胞循环检查点p53和细胞信号蛋白p38参与DNA损伤修复途径。此外，在Ag NPs暴露的生物中caspase-3和caspase-9的活性，细胞凋亡标志物显著增加。结果表明，黑腹果蝇中的Ag NPs具有热休克应激、氧化应激的作用、DNA损伤和细胞凋亡。这项研究表明，这种生物受到压力，因此需要更多的保护。使用体内模型仔细评估Ag NPs，以确定慢性暴露是否具有发展性和生殖毒性。

引言

银纳米颗粒(Ag NPs)是发展最快的纳米颗粒之一纳米技术产业中不断增长的产品种类。Ag NPs用于服装、食品、油漆、化妆品、电子、涂料应用及医疗产品

(Cheng et al., 2004; Cohenet al., 2007; Lee et al., 2007; Vigneshwaran et al., 2007)。在580 .消费类纳米技术产品中最常见的产品描述中的材料是银基纳米颗粒(Woodrow Wilson International Center, 2007)。

纳米颗粒暴露可通过吸入、真皮发生接触和摄入。吸入纳米颗粒的毒理学已经与其他暴露方式相比，这是研究最广泛的途径途径，如皮肤接触或摄食(Kreyling et al., 2006)。纳米材料可以通过以下途径进入胃肠道工作在纳米材料中的人员意外摄入制造工业或纳米材料研究实验室或由饮用或食用被纳米银污染的水或食物从食品包装或废物。最近的研究表明纳米粒子通过胃肠道时可能被吸收通过循环系统分布于全身系统。小鼠摄入的单壁碳纳米管分布于大多数器官和组织(Wang et al., 2004).Hillyer and Albrecht (2001)小鼠血液和组织胶体金纳米颗粒的分布报道。Jani et al. (1990) 表明聚苯乙烯纳米粒子通过摄入进行施用随后在大鼠的血液和几个器官中检测到。青冈鱼暴露于荧光固体乳胶纳米粒子恶魔确定了纳米粒子的均匀分布身体(Kashiwada, 2006)较新的，Kim et al. (2008) 研究了Ag NPs对大鼠的口腔毒性，发现其具有显著的临床意义碱性磷酸酶活性、胆固醇的剂量依赖性变化水平和肝功能。

暴露在不同环境压力下的生物体反应是合成少量高度保守的蛋白质叫做热休克或应激蛋白(Lindquist, 1986) 在不同的应激蛋白，应激诱导热休克蛋白70 kDa (Hsp70)特征明显(Bierkens, 2000) Hsp70已经被认为是一种潜在的环境监测生物标志物。(Ait-Aissa et al., 2000; Siddique et al., 2008) 许多关于纳米颗粒毒性的体外研究报道氧化应激是其中一个最重要的毒性机制与暴露有关纳米粒子(Green and Howman, 2005; Nel et al., 2006; Monteiller et al., 2007) Ag NPs增加自由基生成并消耗殆尽大鼠肝细胞brl3a中谷胱甘肽的含量(Hussain et al., 2005). 过量的自由基生成会引起DNA损伤细胞凋亡(Ryter et al., 2007; Ahamed et al., 2008; Li and Osborne,2008). 包括谷胱甘肽和与蛋白质结合的巯基的活性增加表明脂质过氧化的各种抗氧化酶与细胞分子的氧化损伤有关(Ahamed and Siddiqui, 2007). 大多数纳米毒性研究都集中在体外模型上。纳米毒性的体内研究比体外研究更有意义评估但不幸的是纳米粒子的毒性研究在体内已经非常有限。体内模型通常需要很长的时间的利用哺乳动物系统进行的长期研究。目前研究了Ag NPs对Hsp70氧化性的影响黑腹果蝇的应激、p53蛋白、p38蛋白和细胞凋亡。我们选择黑腹菌属作为模型生物，因为它有详细的遗传学和发育生物学资料。该模型提出的伦理异议较少，属于欧洲替代方案验证中心的建议方法(备选方案) (Benford et al., 2000). 它还允许在短时间内评估由于快速而产生的长期影响复制和发展过程。该模型已用于阐明人类疾病和(Bier, 2005)毒理学研究(Wasserkort and Koller, 1997; Siddique et al., 2008; Siddique et al.,2009). 这种方法构成了更广泛的一个组成部分。筛选系统，我们正在开发，以快速评估这两个体外以及纳米材料在体内的短期和长期毒性(Ahamed et al., 2008).

材料和方法

银纳米粒子。多糖包覆10纳米银纳米颗粒(10nm涂层Ag NPs)由Dan Goia博士慷慨提供克拉克森大学先进材料加工中心波茨坦,纽约)。采用原子吸收法制备了10nm包覆Ag NPs在多糖(金合欢胶)溶液中还原银离子，这导致了表面涂层。接收到的Ag NPs被分散在水中从体积浓度稀释至1mg /ml工作并在35-40 W时超声处理10分钟在混合和形成均匀分散时。

纳米银粒子的透射电镜表征。透射电镜(TEM)表征用日立法测定镀银NPs的尺寸和形貌H-7600钨尖仪，加速电压100kv。纳米粒子沉积后，对银纳米粒子进行了包覆悬浮在涂有碳膜的铜瞬变电磁法网格上。AMT软件对数字TEM摄像机的尺寸测量进行了标定纳米粒子。计算平均尺寸和SD值使用点到点方法(Murdock et al., 2008)

银的动态光散射和激光多普勒测速纳米粒子在溶液中。动态光散射(DLS)和激光多普勒测速(LDV)用于表征流体动力学大小和电动电势(zeta;)Ag NPs在溶液中进行的所述的Malvern Instruments Zetasizer Nano-ZS仪器。（Murdock et al. (2008)）

试剂

还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，还原性谷胱甘肽(GSH)， 5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、硫代巴比妥酸(TBA)、硝基蓝四唑(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)和anti-beta;肌动蛋白抗体，抗hsp70多克隆抗体，抗p53多克隆抗体，抗p38多克隆抗体，第二必要抗体和RIPA缓冲液，Anti-SOD多克隆抗体，Caspase-3和caspase-9检测试剂盒

蝇种和培养。

野生型黑腹果蝇被用于这项研究。选择本品系第三龄幼虫摄食治疗因其爬行活跃，进食枯燥而剧烈。它们是在含有琼脂的标准果蝇食物中长大的，

玉米粉，糖，酵母，大豆粉和丙酸。

银纳米粒子暴露。

两个不同的浓度,50mu;g /毫升和100年mu;g /毫升,AgNPs涨跌互现的标准食物和美联储第三龄幼虫。这些浓度是根据我们之前的选择发表于体外研究(Ahamed et al., 2008) 控制幼虫收到标准的果蝇的食物。幼虫被允许以对照物或食物为食含AgNPs 24和48 h。每只幼虫25只暴露与对照组分别进行一组独立实验和三组独立实验每个实验进行独立的重复。

温度冲击治疗。

Hsp70的表达式的正控制由健康的三龄幼虫组成，置于培养皿中内衬潮湿的滤纸，随后37plusmn;1°C温度如前所述震荡1 h (Krebs and Feder, 1997).

粗提物的制备。

对于氧化应激参数和对照和银NP处理幼虫的半胱天冬酶活性在0.1 M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中均匀化0.15 M KCl获得10% (w/v)组织匀浆。后离心(2300 gtimes;15分钟在4°C)上层清液(原油(提取液)保存在冰上，直到氧化应激试验完成标记物和半胱天冬酶活性。用于西方印迹分析原油提取物的制备方法与上述方法相同，只是采用了RIPA裂解缓冲液1X TBS (0.5 M Tris-HCl和1.5 M NaCl) pH 7.4, 1% NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS, 0.004%叠氮化钠]蛋白酶抑制剂的存在。

脂质过氧化作用。

膜脂过氧化程度为丙二醛(MDA)的测定采用Ohkawa等人(1979)的方法。MDA是终结之一膜脂过氧化的产物。简单地说，0.1 ml的混合物粗提物和1.9 ml 0.1 M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)孵化在37°C 1 h。孵化后的混合物是什么与10%柠檬酸和离心沉淀(2300 gtimes;15分钟室温下)收集上清液。上清液中加入1.0 ml 1% TBA，煮沸15 min。冷却至室温后，取混合物的吸光度在532 nm处转化为MDA，以nmol/h/mg表达蛋白质使用摩尔消光系数为1.56times;10 5 M minus;1 cm minus;1。一个以无粗提物的反应混合物为对照。

谷胱甘肽。

采用埃尔曼试剂定量测定GSH水平。(Ellman, 1959)简单地说，就是0.1 ml的10% (w/v)原油混合物提取和0.9毫升的5%柠檬酸是离心机(2300times;g为15分钟37°C)。然后将0.5 ml上清液加入1.5 ml 0.01%的DTBN中在412 nm处对反应进行了监测。GSH的量为以nmol/mg蛋白表达。

超氧化物歧化酶。

SOD活性是使用前面描述的方法的改进版本确定的(Kakkar et al., 1984) (Nishikimi et al., 1972) 简单地说，在室温下反应是由0.2毫升780mu;M NADH的解决方案添加到一个反应264 M. Ahamed等/毒理学与应用药理学242 (2010)263-269含1.2 ml 0.052 M焦磷酸钠缓冲液的混合物(pH值8.0),0.1毫升186mu;M PMS,0.3毫升300mu;M电视台,0.1毫升蒸馏水和0.1 ml的10% (w/v)粗提物(总体积为2.0毫升)。反应在室温下1.5 min后停止加入1.0 ml醋酸和4.0 ml正丁醇。后离心(2300times;g在室温下15分钟)的颜色在560nm处测定了丁醇中色原的强度。一个无酶反应混合物作为对照。一个单位的酶活性定义为所需的酶浓度室温下1分钟内抑制50%的色原生成以及以单位/min/mg蛋白表达的特异性活性。

过氧化氢酶。

这是黑腹果蝇已知的唯一一种酶在无谷胱甘肽过氧化物酶的情况下清除H2O2。(Mockett et al., 2003) 。采用电泳法测定了黑腹金线莲幼虫的CAT活性。Sinha (1972) 该方法是基于重铬酸盐/醋酸试剂还原成铬醋酸盐存在的H2O2。简单，反应是发起37°C通过将0.5毫升的0.2M H2O2加入到含有1.0 ml 0.1 M磷酸钠的反应混合物中缓冲(pH值7.4)，0.45毫升蒸馏水和10% (w / v)的50mu;l原油提取(总体积2.0 ml)。 1分钟后反应停止加入重铬酸钾/醋酸试剂(5%重铬酸钾)乙酸；1:3v / v)。剩余的H2O2是在570nm处通过测量重铬酸盐/醋酸在H2O2存在下还原生成的醋酸铬酸盐来测定的。无酶源的反应混合物作为对照。CAT特异性活性表达于mu;moles H2O2分解/分钟/毫克的蛋白质。

凋亡检测。

Caspase-3和caspase-9活性为mea-在对照和Ag NP处理的幼虫粗提物中进行了验证标准比色分析试剂盒(Bio Vision, CA)。这个实验是基于在凋亡细胞中活化caspase的原理是分裂细胞合成底物，释放游离的对硝基苯胺(pNA)，用分光光度法在405nm处测定。的在caspase-3和caspase-9特异性作用后产生pNA三肽分别作为底物dev - pna和LEHD-pNA。(Berasain et al., 2005; Siddique et al., 2009)

反应混合物由50mu;l粗蛋白(100mu;g), 50mu;l 2times;反应缓冲区(包含10毫米二硫苏糖醇)和5mu;l DEVD-pNA 4毫米(caspase-3)或LEHD-pNA(用于caspase-9)底物的总体积为105mu;l。反应混合物在37°C 2 h和孵化在405nm处测定产品的吸光度制造商的指示。caspase的特异活性定义为吸光度405nm / 2h /mg蛋白。

图1所示：纳米银粒子的表征。A和B为Ag NPs的TEM表征。AgNPs悬浮液在涂有碳膜的铜网格上干燥。所有图片拍摄200000times;放大和100千伏。采用透射电镜(TEM)测定了188个银纳米颗粒的粒径分布。A为银纳米颗粒的形貌，B为NPs粒径分布的频率。TEM均值plusmn;SD Ag NPs是10.91plusmn;4.58海里。C和D分别描述了Ag NPs的DLS和

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