从石蒜鳞茎中分离出来的石蒜生物碱及其石蒜西定衍生物的抗烟草花叶病毒活性研究外文翻译资料

 2023-01-07 10:40:24

从石蒜鳞茎中分离出来的石蒜生物碱及其石蒜西定衍生物的抗烟草花叶病毒活性研究

杨东琼1,2bull;陈昭荣3bull;陈多志1bull;肖小江1bull;李顺林1

目录

摘要 1

一、 简介 2

二、结果与讨论 4

2.1体内抗TMV活性 4

2.2通过诱导系统叶片中的防御酶活性去抗TMV的抗病毒活性 8

三、实验部分 9

3.1一般实验程序 9

3.2植物材料 10

3.3 石蒜西定衍生物 10

3.4提取和分离 10

3.5抗TMV检测 11

3.5.1筛选材料的制备 11

3.5.2半叶法 11

3.5.3化合物对TMV全身感染的影响 12

3.5.3.1 TMV-CP基因的PCR分析 13

3.5.4防御酶活性测定的测定 13

四、参考文献 14

摘要:从石蒜的球茎中分离出15种已知的石蒜科生物碱。已经通过常规半叶法筛选了一些化合物和石蒜西定衍生物对烟草花叶病毒（TMV）的活性。还通过蛋白质印迹和RT-PCR分析对石蒜西定衍生物进行TMV全身感染的效果测定。测试的化合物显示出中等的灭活效果，而石蒜西定衍生物显示出良好的保护作用。化合物L1（N-甲基-2,3,4-三甲氧基-二甲基吡啶）（60.8％）和L3（N-甲基-2-甲氧基-3,4-丙酮二甲基吡啶）（62.0％）的保护性抑制活性与宁南霉素（66.4％）几乎相似。RT-PCR和Western-blot分析显示化合物L1，L3，L5（N-烯丙基-2,3,4-三烯丙氧基抗坏血酸）显示出抗病毒活性，这可通过减少TMV-CP基因复制和TMV-CP蛋白表达来证明。此外，防御酶活性证实化合物L1可以增加PAL，POD，SOD的活性，从而提高烟草的抗病性。

关键词：石蒜科生物碱；石蒜西定衍生物；石蒜；烟草花叶病毒；抗病毒活性

简介

植物病毒在农业和园艺中造成重大损失，并被称为“植物癌症”[1]。烟草花叶病毒（TMV）被认为是模型病毒并且被广泛研究，它对于植物病理学和经济的研究具有重要的意义。 TMV感染的症状包括烟叶中的叶子变形、高度降低、果实变形和种子发芽率低。TMV导致主要农作物（包括蔬菜和烟草）产生破坏性疾病，导致严重的破坏和巨大的经济损失[2]。到目前为止，很少有抗TMV药剂是高效的。因此，非常需要能够有效控制这些疾病的低价药剂。

近年来，已报道了一系列来自植物的天然产物和具有抗TMV活性的合成化合物，比如以下几种：seco-pregnanesteroids[3],3-acetonyl-3-hydroxyoxindole[4], 7-deoxy-trans-di-hydronarciclasine(DDN)[5],eudesmanolides[6],quassi-noids [7], sesquiterpenoids [8], phenanthroindolizidines and their analogues [9], b-carbolines alkaloids [10]及其衍生物[11]。在这些化合物中，DDN引起了我们的注意。DDN是一种石蒜生物碱，通过半叶法显示出对TMV的强活性，IC50为1.80 lM [5]。我们小组还发现，石蒜西定衍生物显示出对丙型肝炎病毒（HCV）有效的抑制作用[12]。在石蒜科和百合科植物中发现了石蒜素生物碱。石蒜，石蒜科植物，广泛分布于中国南方。它不仅作为五彩缤纷的花卉观赏植物，而且还作为许多国家和地区的各种疾病的民间草药，并且已经报道了它们的多样化活动，如抗TMV [5,13]，抗肿瘤和乙酰胆碱酯酶抑制活性等[14]。

为了进一步评估与HCV相比，石蒜西定衍生物是否对TMV具有相同的作用。在我们正在进行的研究中，我们对石蒜的化学成分和石蒜科生物碱和石蒜西定衍生物的抗TMV活性以及化合物L1的防御酶活性进行了一些研究。结果表明，石蒜科生物碱可以增强植物对TMV的抗性，可以被认为是一种潜在的抗病毒剂。

从石蒜鳞茎中分离出来的石蒜生物碱的抗病毒效应

图1：1-15的化合物来自于石蒜

二、结果与讨论

用石蜡提取石蒜干燥的鳞片，并用SiO 2 CC，Sephadex LH-20和HPLC分离，得到15种已知化合物（图1）。通过比较鉴定化合物的结构，他们的MS和NMR数据与那些在文献中报道的数据有关。他们分别是sanguinine(1)[15], 11-hydroxyvittatine(2)[16],lycoramine(3)[17],pancratinineC(4)[18],homolycorine(5)[19],hippeastrine(6)[20],O-demethylhomolycorineN-oxide(7)[21],zephyranthine(8)[22], O-methyllycorenine N-oxide (9)[23]，lycoranine C (10)[24], tazettine(11)[25],lycorine(12)[26],9-O-demethylhomolycorine(13)[27],homolycorine N-oxide(14)[23], galanthamine (15) [28].

2.1体内抗TMV活性

化合物1,2,6,8,10-13和石蒜碱衍生物（L1-L7）（图2）对TMV的抑制活性通过半叶法测试并报告在表1中，所有化合物均表现出来适度的失效效应。石蒜碱衍生物显示出比疗效更好的保护作用，但两种活性均强于石蒜的化合物。化合物L1（N-甲基-2,3,4-三甲氧基赖嗪）和L3（N-甲基-2-甲氧基-3,4-丙酮二酰嗪）显示出对TMV的保护活性，其抑制率为60.8％，和62.0％，与阳性对照宁南霉素（66.4％）相当。因此，值得进一步研究这些石蒜碱衍生物是否仍然在全身感染宿主N.tabacum cv. K326中具有相同的保护作用。我们在体内进行了测定以及western-blot以分析TMV外壳蛋白（CP）（图3）。结果显示，在接种后3天（3dpi），用化合物处理的接种叶中的TMV-CP积累小于阴性对照的接种叶中的TMV-CP积累（图3a）。系统结果（图3b）在5 dpi TMV-CP中未检测到（L1和L3）或相对较弱（L5，L6）和L7）比阴性对照的。上述结果表明，化合物抑制了TMV的全身性感染。从强到弱的抑制作用顺序为宁南霉素，L1，L3，L5，L6，L7，L2和L4。

图2: 石蒜西定衍生物结构（L1—L7）

表1：在N. glutinosa体内的抗病毒活动

为了进一步证实在石蒜西定衍生物的转录水平上的抗TMV效率，进行了半定量RT-PCR测定，其是高度灵敏且特异的方法。根据TMV-CP分析的Western-blot测定，我们选择了N.tabacum cv的系统叶。 Kd6以5 dpi为材料。结果显示，在5dpi TMV-CP中，治疗组中化合物的全身叶中的转录水平低于阴性对照（图3b）。并且这些化合物对TMV-CP的全身合成具有不同的抑制作用。具体地，抑制作用的降低顺序为宁南霉素，L1，L3，L5，L6，L2，L7和L4。与western-blot分析的结果一致。由上可知，化合物L1，L3和L5通过较低的TMV-CP基因和TMV-CP蛋白的积累而表现出抗TMV活性。在石蒜西定衍生物中，化合物L1和L3在全身叶上显示出相对较高的诱导活性。

图3

A是在3dpi下用石蒜碱衍生物(L1-L7 (100mu;g/mL)处理的接种叶中TMV外壳蛋白积累的Western印迹分析。

B在5dpi时系统叶片中1MV外壳蛋白积累的Western印迹和RT-PCR分析。

CK阴性对照，宁南霉素、肌动蛋白和RbeS作为内部参考

图4用化合物L1(100mu;g/mL)处理的烟草植物中的PAL(a),POD(b)和SOD(c)活性模拟健康的烟草;所有结果均表示为平均值土SD;所有组的n=3

2.2通过诱导系统叶片中的防御酶活性去抗TMV的抗病毒活性

在体内筛选结果的基础上，石蒜西定衍生物显示出良好的保护作用。据我们所知，当植物被各种侵略性病原体感染时，为了保护自己，他们开发了各种防御反应，例如防御酶活性。苯丙氨酸解氨酶（PAL），过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）很重要的防御酶。 PAL是水杨酸（SA）生物合成和SAR建立的关键调节酶[29]。 POD和SOD是抗氧化酶，在保护植物免受损害方面发挥重要作用，可有效去除植物中的过氧化氢，超氧阴离子自由基和其他活性氧，减少膜系统的损伤，防止脂质氧化。 选择具有良好抗TMV活性的化合物L1来研究防御性酶活性。 图4中的数据显示了化合物L1处理下PAL，POD和SOD活性的变化。 PAL参与了苯丙素的生物合成，可以产生SA以防御病原体[30]。化合物L1 TMV治疗组高于其他治疗组。化合物L1处理下的PALTMV治疗组从第1天增加到第5天，并在第5天达到最高值（图4a）。当植物遭受外来压力时，POD活性可以增加以改善植物的适应性是常见的。L1的POD之间的活性有差异，TMV治疗组和其他治疗组无显着差异（图4b），但化合物L1 TMV治疗仍然高于其他人。SOD的主要功能是去除植物中的超氧阴离子，通常SOD活性越高，植物产生的抗性越强。在化合物L1处理组中，显着高于其它烟草的SOD活性在第1天至第5天增加，在第5天达到最大值，并从第5天降至第7天（图4c）。这些结果表明，化合物L1可以保护植物免受病原体的侵害，这与防御酶活性的提高有关。

总之，从石蒜的球茎中分离出15种已知的石蒜科生物碱。一些化合物和石蒜西定衍生物显示出中等的灭活作用。石蒜西定衍生物显示出有效的保护作用。化合物L1，L3和L5可以降低TMV-CP的积累和基因转录，特别是化合物L1和L3表现出较好的保护作用。防御性酶活性测定

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