新型微卫星标记的分离与鉴定 ——白芨（Bletilla striata）和2种同类特异性扩增种类外文翻译资料

 2023-01-07 10:41:34

新型微卫星标记的分离与鉴定

——白芨（Bletilla striata）和2种同类特异性扩增种类

原文作者：Yusi Zhang bull; Beiwei Hou bull; Weiming Zhang bull; Xiaoyu Ding

单位名称：南京师范大学生命科学学院

摘要: 白芨（Bletilla striata）（兰科）是一种濒危物种植物种类，它具有较高的观赏价值和药用价值。重要的是要了解它的分子证据以保护其濒危物种。评估遗传多样性和遗传多样性白芨的种群结构。10个多态微观卫星是从微卫星富集的发展而来的库。其中测试了微卫星位点多态性共有31个人。 每个等位基因的数量位点范围从4到11，平均每个有7.5轨迹。 观察到的和预期的杂合性范围很广，从0.3077到0.6923，从0.4908到0.8153。 所有基因座的跨物种扩增是在两个同类物种中取得成功。 10微本研究中确定的卫星位点可用作新颖的进一步研究保护遗传学的标记白芨及其同属物种。

关键字：白芨；微卫星；生物素链霉抗生物素蛋白捕获方法；遗传多样性；保护

白芨（Thunb.ex A. Murray）Rchb 是一个多年生的具有高观赏性和药用价值的草本类植物。它是兰花科的Bletilla H. G. Reichenbach属。白芨（Bletilla striata）是一种著名的中药具有优良的药用价值，类如止血，消退肿胀，恢复体力，减少痰，抗溃疡，美白等一系列的作用， 但如今白芨（Bletilla striata）已成为濒临灭绝的物种了。由于近期过度没有规则的开采造成的植物资源野生的减少，为可持续发展而全面利用这种野生植物，有必要了解它在种群内和种群间的遗传变异。然而，直到现在，有限的分子标记已经存在在这个属中发展起来了。在这项研究中，我们一共进行分离了10个新型使用生物素的白芨微卫星标记链霉抗生物素蛋白捕获方法并测试其可转移性另外2种同类物种：白芨（Bletilla ochracea Schltr）。和Bletilla formosana（Hayata）Schltr。

我们一共在安徽省收集到了31个野生白芨（B. striata）的个体。总共具有八个B. ochracea个体。山西省和山东省收集了B. formosana与贵州省相分开。 每个基因组的DNA用新鲜或干燥的叶子提取标准CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）样品。样品DNA被限制性消化为碎片使用Sau3A1（TaKaRa，200至750 bp，日本）。将片段连接到双链上的接头处通过T4 DNA连接酶（TaKaRa，日本）然后使用一个进行merase chain reaction（PCR）连接子链作为它的引物。PCR产物是热变性并与生物素化寡核苷酸杂交核苷酸探针（AAG）10，（AT）10和（GCA）10。 这些通过链霉抗生物素蛋白包被的磁性预混合杂化物珠子（Promega，Madison，WI，USA）和微卫星 - 含有碎片的富集和回收（格伦和Schable 2005; 范等人。2009）。118个菌落使用M13引物和76阳性筛选插入片段对含有微卫星位点的菌落进行了测序。

表1 B. striata中10个多态微卫星标记的特征

序号 加入

引物（5rsquo;-3rsquo;）

染料 温度

尺寸 重复主题 NA Ho He

YSZ001 KP052819

YSZ002 KP052820

YSZ003 KP052821

YSZ004 KP052822

YSZ005 KP052823

YSZ006 KP052824

YSZ007 KP052825

YSZ008 KP052826

YSZ009 KP052827

YSZ010 KP052828

F:TCCGTCCACTCGAAATCCA

R:CGTAAACTTCAGCAGGCTAACA

F: TCTAGGCCAGAGCGGCAGTA

R: CGGTCACAAATCCGTATCCAA

F: TAATGCCCAAGCCCTCG

R: TTTCTACATCGGCGCTAACC

F: TGTCGGGTAGGGTAGGAATG

R:GAGGCTCAACCTGAACAATAAT

F: CTCAGATTCGCCCAGTTTCC

R:TTGAGGTGGATGAAGAAGAAGG

F: GGAGTGTTCTCCGTGACGTC

R: GGTCACAAATCCGTATCCAA

F: TTCCTCATCACCGTCCACA

R: AGACAAGTGCTAGGGTTCAAAA

F: CGGATTCCAAACAGGGAG

R: TCACGCAAAACGAGACGA

F: CTCGTCTACATTTCACCCTTCTG

R: CTGTATGGGTCGTATGCTAACTC

F: TCCGGCAAAGGGATTTAT

R: TGGTGGAACAGGCAGGTGA

6-FAM 56

HEX 55

TAMRA 58

HEX 57

6-FAM 55

6-FAM 60

TAMRA 60

TAMRA 56

TAMRA 58

6-FAM 57

178 (CTT)10 9 0.6316 0.7937

307 (CTT)5((CTT)8 5 0.4286 0.5714

269 (CTT)14 9 0.6923 0.7302

330 (CTT)3(CTT)5 6 0.3077 0.6862

288 (CTT)14(CTT)5 10 0.6316 0.7937

132 (CTT) 8 11 0.6667 0.8153

122 (CT)11 4 0.3684 0.4908

338 (CT)24 6 0.3846 0.5977

315 (TA)11 7 0.4615 0.5075

155 (TGC)7 8 0.6471 0.7398

Ta退火温度，N个每个位点的等位基因数，He预期杂合性，Ho观察杂合度

分离的微卫星在北京基因组学研究所进行了测序（中国北京）。使用OLIGO 7等软件，引物对是在此基础上设计的上游和下游的侧翼序列微卫星重复基序列。

我们为了确定这些候选的有效性微卫星，PCR总扩增进行了31次个人收集。根据侯等人的说法进行PCR反应（2012年）。通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳解析（PAGE）和银染用于初步扩增产物实验。选择其中10对引物进行合成B. striata样品中的显着多态性（见表1）。该PCR产物在ABI PRISM上电泳3500XL遗传分析仪（Applied Biosystems，Foster市，加利福尼亚州，美国）与GeneScan 600 Tamara分子大小使用标准品和等位基因大小确定GENEMAPPER v4.1软（Applied Biosystems）。该期望的杂合性（He），观察到的杂合性（Ho）和每个测试基因座的等位基因数（N A）由Arlequin ver估计值为3.11（Excoffier等，2005）。GENEPOP 3.4软件包（Raymond和Rousset1995年被用来执行哈代的精确测试Weinberg平衡（HWE）和连锁不平衡（LD）由微卫星位点。

在所测试的76个候选基因座中，有10个多态性基因座成功扩增并且命名为YSZ001至YSZ010并与GenBank相对应登记。KP052819-KP052828同样进行标记（见表1）。 对于10个基因座中的每一个，等位基因的数量范围从4到11，平均值数量为7.5; 观察到的杂合性不同于0.3077至0.6923，平均值为0.5220;该预期杂合度范围为0.4908至0.8153平均值为0.673。在15个位点中，只有标记YSZ007显示出与Hardy的重大偏差 - 温伯格均衡。对于2个同类物种，共有10个证明引物对具有可转移性。这时我们可以得出结论：这些微卫星位点可用于评估B. striata和B.的遗传多样性和遗传结构同类物种野生种群。

致谢：这项工作得到了National Nat-的支持，中国科学基金（No. 31170300）和国家科学和技术支持计划（No. 2011BAD33B03），再此对予其支持表示真挚的感谢。

外文文献出处：

Excoffier L, Laval G, Schneider S (2005) Arlequin (version 3.0): anintegrated software package for population genetics dataanalysis. Evol Bioinform Online 1:47–50

Fan WJ, Luo YM, Li XX, Gu S, Xie ML, He J, Cai WT, Ding XY(2009) Development of microsatellite markers in Dendrobiumfimbriatum Hook, an endangered Chinese endemic herb. MolEcol Resour 9:373–375

Glenn TC, Schable NA (2005) Isolating microsatellite DNA loci.Methods Enzymol 395:202–222

Hou BW, Tian M, Luo J, Ji Y, Xue QY, Ding XY (2012) Geneticdiversity assessment and ex situ conservation strategy of theendangered Dendrobium officinale (Orchidaceae) using newtrinucleotide microsatellite markers. Plant Syst Evol 298:1483–1491

Raymond M, Rousset F (1995) GENEPOP (version 1.2): populationgenetics software for exact tests and ecumenicism. J Hered 86:248–249

附外文文献原文：

Isolation and characterization of novelmicrosatellitemarkers

for Bletilla striata and inter-specific amplification in 2 congeneric species

Yusi Zhang bull; Beiwei Hou bull; Weiming Zhang bull;Xiaoyu Ding

Abstract ：Bletilla striata (Orchidaceae) is an endangeredplant species with high ornamental andmedicinal value. Itis important to acquaint the molecular proofs to protect thisendangered species. To evaluate the genetic diversity andpopulation structure of B. striata, 10 polymorphic micro-satellites were developed from microsatellite-enrichedlibraries. Microsatellite loci polymorphism was testedacross a total of 31 individuals. The number of alleles perocus both ranged from 4 to 11, with an average of 7.5 perlocus. The observed and expected heterozygosities rangedfrom 0.3077 to 0.6923 and from 0.4908 to 0.8153,respectively. Cross-species amplification of all loci wassuccessful among two congeneric species. The 10 micro-

satellite loci identified in this study can be utilized as novelm

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