药用植物栝楼（吊瓜）高效的愈伤组织再生及离体根瘤化外文翻译资料

 2023-01-07 10:41:47

药用植物栝楼（吊瓜）高效的愈伤组织再生及离体根瘤化

原文作者：Fenglan Zhao1 amp; Rong Wang1 amp; Jianping Xue1 amp; Yongbo Duan1

单位：The Society for In Vitro Biology

摘要：栝楼，是一种具有相当药用价值的攀缘草本植物。本研究建立了该植物愈伤组织介导再生和体外结核化的有效方案。用植物生长调节剂（PGR）和促进愈伤组织诱导和再生的添加剂，在基础（MS）培养基上培养无菌茎叶组织。在添加4.5-mu;m 2,4二氯苯氧乙酸（2,4-d）的MS培养基上，茎叶组织对愈伤组织的诱导反应均为最佳（100%）。将愈伤组织置于4.6mu;m的激动素、2.2mu;m的6-苄基氨基嘌呤、2.7mu;m的1-萘乙酸（NAA）和12.6mu;m的硫酸铜中，获得了有效的芽器官发生，再生率为85.5%，每个愈伤组织有28个芽。以2.7mu;m NAA为基质，半强度（1/2）MS培养基对离体芽的根除效果最好。在短光照（8h光周期）条件下，5%（w/v）蔗糖生根培养基能有效地诱导块根。生根植株在盆栽中成功驯化，成活率大于90%。本方案为愈伤组织介导的再生和离体根瘤化提供了一种有效的方法。

关键词：栝楼。愈伤组织。芽器官发生。硫酸铜。离体根瘤化

栝楼 linn。是一个重要的属葫芦科，由50多种植物组成广泛分布于澳大利亚、中国、日本，朝鲜和东南亚。在这些物种中，天花粉。是一种多年生植物，具有观赏、烹饪和药用价值。它通常会生长高达6米，具有爬行生长形式（Wang等人2009年），使其成为垂直绿化的重要观赏植物。经过适当的处理，它的种子是流行的健康食品或零食。更重要的是，它包含多种生物活性成分被证实对心脏和肺部疾病有效治疗（Shu等人2009）咳嗽，炎症，糖尿病（dat等人。2010）和肿瘤（Lee等。2013）。在栝楼的块根中，大约有27kDa无活性的核糖体蛋白，称为旋毛虫肽，具有广泛的药效，包括抗肿瘤（崔等。2015）和抗免疫缺陷特性（阳等。2014）。因此，栝楼被列为50种基本草药，是中国药草中的大宗商品。（Fan等人2013）。然而，环境条件的恶化和过度开发对野生栝楼种群构成了严重威胁。因此，迫切需要利用商业手段生产足够的栝楼原料。

栝楼种子发芽率低阻碍了大规模种植（徐、张2008）。一般来说，采用分根法扩大种植面积，但此法营养增殖系数低，且种质退化阻碍了这些扩大规模的方法。因此，开发更多的组织培养技术将是促进栝楼大型化生产的有效途径。在目前的研究中，多用组织培养进行本种的大规模体外繁殖。

从安徽天柱山（北纬30°44′12.99〃，东经116°27′18.84〃）采集栝楼并保存在陶罐中。这些植物被用作外植体组织的来源（来自茎和叶）用于本研究。

Murashige和Skoog (MS)培养基(Murashige和Skeoog 1962)在全强度下用于愈伤组织诱导和芽再生，在半强度下用于离体生根和根瘤形成。培养基中含有3%(w / v)蔗糖和0.3%(w / v)Phytageltrade;和高压灭菌后强化植物生长调节剂(pgr)和有机和无机补充剂。使用100 mM KOH将每个培养基的pH调整为5.8。培养基在103千帕和121摄氏度下高压灭菌20分钟。除非另有说明，培养物在冷白色荧光灯（中国上海嘉丰园艺用品有限公司）提供的16小时光周期下保持在25plusmn;1摄氏度，辐照度为35-mu;molm-2 s-1 ，相对湿度为60%。使用的MS培养基、蔗糖和PGR来自Sigma Aldrichreg;（密苏里州圣路易斯）

表1. 植物生长调节剂对栝楼愈伤组织再生的影响

BAP (mu;M) KT (mu;M) NAA (mu;M) 愈伤组织生芽% 每个愈伤组织的芽数

8.8 0 1.1 0 0

8.8 0 2.7 0 0

8.8 2.3 1.1 1.64 plusmn; 0.3e 1.3 plusmn; 0.6d

8.8 4.6 2.7 1.62 plusmn; 0.4e 1.3 plusmn; 0.6d

2.2 2.3 1.1 25.0 plusmn; 7.6c 11.3 plusmn; 3.1c

2.2 4.6 2.7 59.4 plusmn; 3.5a 28.1 plusmn; 1.1a

0 2.3 1.1 18.9 plusmn; 5.0d 18.5 plusmn; 1.0b

0 4.6 2.7 34.4 plusmn; 5.4b 11.3 plusmn; 0.6c

根据Duncan的多范围试验，同一列中不同字母后面的值在plt;0.05时显著不同。

KT，刺激素；BAp，6苄基氨基嘌呤；NAA，1-萘乙酸.

将节茎浸入1.5-mm的二氧化氯水溶液（中国北京毕节市环境友好技术开发有限公司）中25分钟，（Duan等人2016）消毒后的外植体用消毒水冲洗5次，表面贴在消毒过的滤纸上，插入MS培养基中。消毒外植体用消毒水冲洗5次，表面贴在消毒滤纸上，插入含1.3-mu;m 6-苄基氨基嘌呤（BAP）和0.3-mu;m吲哚-3-丁酸（IBA）的MS培养基中繁殖（林 等人2010），以原茎为导向垂直插入外植体。

无菌苗长到5厘米后，将茎段和叶片分别切成约1.0厘米长和1.0厘米2段，置于含有4.5-mu;m 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d）的MS培养基上诱导愈伤组织。每培养皿培养10个外植体，叶片背面朝下，茎平放在培养基上。培养物在25plusmn;1°C的黑暗中培养4周。

表2。硫酸铜1/2 ms培养基上栝楼植株的再生

硫酸铜 (mu;M) % 生芽愈伤组织 每个愈伤组织的芽数

0 61.0 plusmn; 7.5b 30.0 plusmn; 2.3a

12.6 85.5 plusmn; 9.1a 28.7 plusmn; 3.0a

31.5 39.4 plusmn; 6.3c 19.1 plusmn; 1.4b

半强度MS（1/2 ms）培养基（Murashige和Skoog 1962），用4.6-mu;m 激动素、2.2-mu;m 6苄基氨基嘌呤、8.8-mu;m 1-萘乙酸和不同浓度的硫酸铜强化。根据Duncan的多范围试验，同一列中不同字母后面的值在plt;0.05时显著不同。

为了优化体外器官发生的培养基，将易碎的愈伤组织转移到含0.0、2.2或8.8mu;m BAP、0.0、2.3或4.6mu;m激动素（KT）和1.1或2.7mu;m 1-萘乙酸（NAA）的MS培养基中。四周后，计算出产生芽的愈伤组织百分比和每个愈伤组织的芽数。研究了0.0、12.6、31.5mu;M硫酸铜水溶液对愈伤组织分化的影响。当嫩枝长到3厘米长时，将其转移到360毫升的塑料瓶中（78毫米times;78毫米times;95毫米），其中60 ml半强度MS培养基，2.7-mu;m NaA用于生根。将生根植株移入含蒸压商业营养土壤（80%砂质壤土、10%蛭石和10%珍珠岩）的5-L塑料盆中，并在25plusmn;1°C的温度下在温室中生长。将再生苗移入含半强度MS培养基的250 ml烧瓶中，用2.7mu;m NaA生根，用3%、4%、5%、6%或7%（w/v）蔗糖浓度诱导块根。培养物在凉爽的白色荧光灯（中国上海嘉丰园艺用品有限公司）提供的8小时光周期中培养，其辐照度为35-mu;mol光子m-2s-1。用直尺测量直根长度，5周后用游标卡尺在基部测量根径。

每次处理60个外植体（n=60）。所有的实验都重复三次。使用IBMreg;SPSS 19.0版（IBMreg;Armonk，NY）对数据进行统计分析。采用方差分析（ANOVA）确定统计学显著性，采用邓肯多范围检验（Plt;0.05）计算平均值plusmn;标准差（SEM）值之间的显著差异。

培养开始后7天，茎段两端出现扩张，2周后开始出现愈伤组织。对于叶片外植体，2周后也从边缘出现愈伤组织。茎叶均产生愈伤组织，茎叶组织的愈伤组织诱导率均达到100%。

检测细胞分裂素（BAP和KT）和NAA，以及它们之间的相互作用对愈伤组织有显著影响。差异化（表1）愈伤组织扩张，芽原基转移到再生培养基后形成2周（图1a）。在另外2周内形成芽（图1b）。含4.6mu;m KT、2.2mu;m BAP和8.8mu;m NAA的MS培养基的成苗率明显高于其他培养基，其中59.4%的愈伤组织片形成苗。值得注意的是，当8.8mu;m的BAP单独加入到再生培养基中时，1.8mu;m或2.7mu;m的NAA在两种处理中都没有再生芽，当8.8mu;m的BAP与2.3mu;m或4.6mu;m的KT结合时，产生极少量的芽。在8.8mu;m BAP存在下，大部分愈伤组织在1周后开始扩张。然而，愈伤组织变成褐色，最终死亡。结果表明，8.8mu;m BAP对植株再生有抑制作用，2.2mu;m BAP与4.6mu;m KT对植株再生有协同作用。相反的结果记录在香蕉培养中，其中BAP比KT更能有效地诱导芽（Muhammad等人2007年）。这种差异可能是由植物种类的差异造成的。

2周内，在生根培养基上生根，形成一个健壮的根系。土壤驯化后的根芽生根率大于90%（图1c，f），表明栝楼试管苗易于生根。

为了研究硫酸铜对栝楼愈伤组织的分化是否有影响，用优化的PGR在再生培养基中加入硫酸铜。再生培养基中加入12.6mu;m硫酸铜后，愈伤组织分化率提高到85.5%，明显高于不添加硫酸铜的愈伤组织（Plt;0.05），而每个愈伤组织的总苗数没有明显降低（Pgt;0.05）。再生培养基中加入31.5mu;m硫酸铜后，各愈伤组织的愈伤组织分化率和总芽数均下降（表2）。说明12.6mu;m硫酸铜能有效促进栝楼愈伤组织的分化。其他植物如高粱等也有类似现象（吴等2014年），（Rauvolfia SerpentinaAhmad等人以及Zea Mays L.Cho等人2015）

各培养愈伤组织均能很容易地产生近30个植株（表2），其产量明显高于栝楼叶或茎直接再生。这些结果表明，本文提出的方法为栝楼的体外繁殖提供了一种更有效的方法。

当3-7%（w/v）蔗糖添加到生根培养基中时，长度和直径受到影响（图1d，e）。根长随蔗糖浓度的增加而减小，说明高浓度的蔗糖促进根的膨胀，而不是促进根长的增长。与其他处理相比，3%蔗糖处理的根系最长（Plt;0.05）。同样，含5%（w/v）蔗糖的培养基的根径增加到0.89 cm，而含3%（w/v）蔗糖的培养基的根径增加到0.11 cm（plt;0.05）。当蔗糖浓度不断增加时，根系直径没有增加（表3）。结果表明，在生根培养基中添加5%（w/v）蔗糖，可促进基里洛韦根的块茎化。在曼尼奥特蔓藤中也发现了蔗糖的类似影响。（木薯）用于体外块根诱导（Wu等人2014b）。这可能是由于蔗糖浓度的增加提供了更多的能量和碳骨架，同时改变了渗透压以利于根系的膨胀。

本研究确定了栝楼愈伤组织介导的再生和离体根瘤化的有效方案。叶片和茎外植体在MS培养基上均能产生高质量的愈伤组织，其中4.5mu;m 2，4-d。在MS培养基上，辅以4.6mu;m KT、2.2mu;m BAP、2.7mu;m NAA和12.6mu;m硫酸铜，愈伤组织再生效果最好。

结果表明，愈伤组织再生率为85.5%，每个愈伤组织再生28个芽。采用半强度（1/2）MS培养基和2.7mu;m NAA进行离体生根。在5%（w/v）蔗糖生根培养基上有效地诱导块根。生根植株在盆栽中成功驯化，成活率大于90%。本方案是一种有效的栝楼愈伤组织诱导再生和离体根瘤化方法。

表3。蔗糖对栝楼生根和块茎化的影响

蔗糖浓度 (%, w/v ) 生根率 (%) 根长(cm) 根直径 (cm)

3 100 9.87 plusmn; 1.19a 0.10 plusmn; 0.03d

4 100 8.47 plusmn; 1.01a 0.27 plusmn; 0.07c

5 100 5.70 plusmn; 0.56b 0.83 plusmn; 0.09a

6 100 6.17 plusmn; 0.47b 0.59 plusmn; 0.06b

7 100 6.27 plusmn; 0.59b 0.60 plusmn; 0.03b

半强度MS（1/2ms）培养基（Murashige和Skoog 1962），用2.7-mu;m 1-萘乙酸和不同浓度的蔗糖强化。在plt;0.05时，不同字母后面的值显著不同。

资金信息 本工作得到国家自然科学基金（31501368, 81573518）、安徽省自然科学基金、中国（1608085 MC52）、中国安徽省大学自然科学研究项目（KJ2016B016）的资助。

参考文献

Ahmad

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