钙调素结合蛋白60家族负调控和正调控的植物免疫外文翻译资料

 2023-01-07 10:43:25

钙调素结合蛋白60家族负调控和正调控的植物免疫

原文作者：William Truman2, Suma Sreekanta2, You Lu, Gerit Bethke, Kenichi Tsuda3,Fumiaki Katagiri, and Jane Glazebrook

单位：单位植物生物学和微生物与植物基因组学研究所（W.T.、S.S.、Y.L.、G.B.、K.T.、F.K.、J.G.）和明尼苏达州圣保罗市明尼苏达大学植物 生物科学研究生课程（S.S.，Y.L.），55108

调素结合蛋白60（CBP60）基因家族含八个成员，其中CBP60g和系统获得性抵抗缺陷1（SARD1），是促进水杨酸（SA）产生、并影响SA依赖和SA独立防御基因的表达的植物免疫的正调节因子。在这里，我们研究了拟南芥中该家族的其他六个家族成员的相关功能。只有cbp60a突变体影响细菌病原体丁香假单胞菌pv黄斑病ES4326的生长。与cbp60g和sard1突变体相比，cbp60a体突变降低了病原体的生长，表明CBP60a是免疫的负调节因子。cbp60g突变体仅在CBP60a存在的情况下增加细菌的生长，而sard1突变体引起的生长增加与CBP60a无关，这表明CBP60g的主要功能可能是对抗CBP60a的抑制作用。在没有病原体的情况下，cbp60a植物中SA以及几种SA依赖性和SA非依赖性病原体诱导基因的水平比野生型更高，这表明cbp60a植物的抗性增强可能是由病原体攻击前的免疫反应激活引起的。CBP60a结合钙调蛋白，钙调蛋白结合结构域定位于蛋白质的C末端。编码缺乏结合钙调蛋白能力的CBP60a突变形式的转基因未能成功回补无义突变，表明钙调蛋白结合能力是CBP60a的免疫抑制功能所必需的。CBP60节点的调节涉及CBP60a的负调节以及CBP60g和SARD1的正调节，提供对免疫应答激活的多重控制。

植物先天免疫依赖于对病原体攻击的识别、复杂信号网络的激活和防御基因的表达。一种类型的识别是由质膜中的病原体识别受体介导的，这种受体结合微生物的分子特征，称为微生物相关分子模式（MAMPS），从而产生模式触发免疫（PTI）。适应的病原体产生效应蛋白，通过靶向受体本身或防御信号机制的关键成分来促进毒力。第二类病原体识别涉及通过植物抗性蛋白检测病原体效应蛋白，从而产生效应因子触发免疫（Eti；Jones和Dangl，2006年）。在PTI中，早期反应会迅速识别病原体，包括Ca2 流入细胞质和细胞核（Gust 等，2007；Ranf 等，2011，2012），氧化爆发（Goacute;mez-Goacute;mez 等，1999），细胞壁上的愈伤组织沉积（Goacute;mez-Goacute;mez 等，1999），以及有丝分裂原激活蛋白激酶级联的激活（Zhang and Klessig，1998；N_hse 等，2000；Zhang 等，2000）。几个小时后，产生信号激素乙烯、茉莉酸-Ile共轭物和水杨酸（SA），并调节大量基因的表达变化（Dodds和Rathjen，2010）。PTI的效果可以通过用MAMP预处理植物来观察，例如来源于细菌鞭毛蛋白的肽flg22，然后以毒性病原体进行接种（Zipfel等，2004；Tsuda等，2009）。在用MAMP预处理的植物中，病原菌的生长会减少，这可能是由于在病原菌攻击前防御系统的激活。ETI反应通常包括一种被称为超敏反应的程序性细胞死亡形式，以及乙烯、茉莉酸-Ile结合物和SA的产生以及基因表达的相关变化（Dodds和Rathjen，2010）。

本研究中所研究的病原菌，丁香假单胞菌pv黄斑病菌株ES4326（Pma ES4326），是一种中度毒性的病原菌，在拟南芥中不会引发ETI反应（Arabidopsis Thaliana；Dong等，1991）。它确实会引起强烈的SA反应，这对于限制病原菌的生长是很重要的，因为SA生产或SA信号中有缺陷植物突变体，比野生型允许更多的细菌生长（Glazebrook等，1996）。野生型水平SA产生的需要相关的脂肪酶样基因增强疾病敏感性1（EDS1）和植物保卫素缺陷4（PAD4），这也是许多SA独立基因表达变化对感染的反应所必需的（Falk等，1999；Jirage等，1999；Wiermer等，2005；Wang等，2008）。EDS1和PAD4间接增加水杨酸诱导缺陷2 /异分支酸合酶（SID2 / ICS1）的表达，它编码异分支合成酶是SA合成所需的酶（Wildermuth等，2001）。SA信号由非表达致病相关基因3（NPR3）和NPR4蛋白检测，导致NPR1易位至细胞核，通过与转录因子的物理相互作用控制基因表达（Zhang等 ，1999; Mou等，2003； Dong，2004； Fu等，2012）。

SA信号也受钙调素结合蛋白60家族的两个成员CBP60g和SARD1的影响（Wang等，2009、2011；Zhang等，2010）。这两个基因都是由flg22处理或Pma ES4326感染诱导的，CBP60g的反应比SARD1快（Wang等，2009，2011）。任何一个基因的单一突变都会导致Pma ES4326的生长适度增加（Wang等，2009，2011）。cbp60gsard1双突变体可显著增加Pma ES4326的生长，降低SA的水平（Wang等，2011年）。对细菌生长的影响大于sid2，而对SA的影响小于sid2，这表明突变也影响SA独立防御反应（Wang等，2011）。在Pma ES4326感染后24小时，植物的表达谱显示出这种不依赖SA的防御。在cbp60g sard1植物中表达受影响的基因包括SA依赖性基因以及在pad4和eds1植物中表达受影响的SA非依赖性基因的子集（Wang等，2011）。该分析将CBP60g/SARD1信号节点置于免疫信号网络中的PAD4/EDS1和SA节点之间（Wang等，2011年）。CBP60g在体外结合钙调蛋白（CaM），而SARD1则没有（Wang等，2009,2011）。

CBP60g的CaM结合域位于附近N末端（Wang等，2009）。基因编码不能结合CaM的定点突变体未能回补Pma ES4326生长表型，表明CaM结合是CBP60g免疫功能所必需的（Wang等，2009）。CaM是一种小分子蛋白质，几乎完全由四个所谓的“EF-hand”结构域组成（Chin和Means，2000）。每个EF-hand以微摩尔亲和力结合一个Ca2 离子，导致蛋白质的构象变化（Chin和Means，2000）。CaM通过以Ca2 依赖性方式与其结合来控制其他蛋白质的活性来介导Ca2 信号（Chin和Means，2000）。在CBP60g的情况下，CaM结合仅在Ca2 存在下发生（Wang等，2009）。这些结果表明，CBP60g构成了病原体识别后早期发生的Ca2 流入与随后产生的SA和SA独立免疫基因表达之间的联系（Wang等，2009）。它被提出在防御的激活中可能提供一个类似的功能，但以Ca2 独立的方式，允许在Ca2 回到静息水平后持续防御（Wang等，2011）。

在染色质免疫沉淀分析中，CBP60g和SARD1都被证明位于核内与SID2启动子结合（Zhang等，2010）。使用电泳迁移率变动分析，发现两种蛋白质的中心部分与序列GAAATTTTGG的寡核苷酸结合（Zhang等，2010）。该序列的一部分GAAATTT在25个基因的启动子中过量表达，其中发现病原体诱导的表达在cbp60g sard1植物中降低（Wang等，2011）。结果表明，CBP60蛋白可能直接与它们控制的基因的启动子结合，从而影响它们的转录（Zhang等，2010）。

通过使用ATH1微阵列获取的挖掘表达谱数据，探讨了CBP60g/SARD1调控的范围。选择了CBP60G、SARD1与SID2共表达的实验。在这些实验中，选择了与CBP60G SARD1植物中受影响的44个基因强共表达的基因。然后根据共表达的强度对该基因集进行聚类。用定量实时（qRT)-PCR分析了cbp60g sard1对富含GAAATT启动子基序的典型基因簇表达的影响。在cbp60g sard1植物中，启动子富含GAAATT基序的部分基因表达降低，而其他基因表达不受影响，部分基因表达增加。这些结果表明，GAAATT基序的富集不是CBP60g/SARD1依赖性诱导基因表达的充分条件（Truman和Glazbrook，2012）。

CBP60g和SARD1也与对非生物胁迫的反应有关。这两个基因都是在对寒冷的反应过程中被诱导的，其动力学遵循同样被诱导的SID2（Kim等，2013）。目前尚不清楚CBP60g和SARD1是否需要用于SID2的冷诱导。CBP60g的过度表达导致对干旱胁迫和脱落酸的耐受性增加，而cbp60g植物的敏感性增加（Wan等，2012）。

拟南芥CBP60基因家族包含8个成员。鉴于CBP60g和SARD1在生物和非生物应激反应中的已知作用，我们决定通过检测这些基因突变对Pma ES4326生长的影响来检测其他六个家庭成员在生物应激反应中的作用。只有cbp60a突变体具有显著的表型，与野生型植物相比，细菌生长减少。在没有病原的情况下，cbp60a植株的SA水平和所选病原诱导基因的表达均升高。CBP60a的CaM结合域位于蛋白质的C端，而CBP60g的CaM结合域位于N端附近。CBP60a的CaM结合能力是对cbp60a无效突变体减少细菌生长表型的补充。与CBP60g和SARD1相比，CBP60a是免疫抑制因子。

结果

CBP60a对植物免疫有负面影响

由于cbp60g和sard1突变损害了植物免疫，使Pma ES4326的生长得以增强，我们决定检测其他6个CBP60家族成员的突变对Pma ES4326生长的影响。如图1a所示，两个独立的cbp60a T-DNA（T-DNA）等位基因插入突变体导致Pma ES4326的生长减少，表明cbp60a植物对该病原体的免疫增强。在其他测试的cbp60 T-DNA插入突变中，cbp60c和cbp60d的突变导致Pma ES4326的增长非常小，但在统计学上显著增加。这些微小的差异没有进一步研究，可能是由于T-DNA系的二次突变，因为没有检测到其他等位基因。野生型CBP60a构建物含有天然内含子和启动子，带有C末端血凝素（HA）标记，回补了cbp60a-1突变体的Pma ES4326生长表型，进一步证实cbp60a的突变增强抵抗力（图1b）。另外两个丁香假单胞杆菌株的生长。在cbp60a植株中，番茄菌株DC3000（PTO DC3000）和表达R蛋白RPS2、PTO DC3000 AVRRPT2识别的效应器突变菌株的生长受到抑制（图1、C和D）。因此，CBP60a作为免疫抑制因子发挥作用，而CBP60g和SARD1是免疫激活因子。CBP60a、CBP60g和SARD1定义了一个与其他5个CBP60基因不同的分支（Wang等，2011），并且该分支的每个成员在免疫中起作用。

Pma ES4326接种可诱导CBP60a的mRNA表达水平，但其程度远小于CBP60g或SARD1。CBP60a的表达不受cbp60g、sard1和sid2突变的影响，表明它独立于CBP60g、SARD1和SA。CBP60g和SARD1的表达在CBP60a植物中没有受到影响（补充图s1）。

图1 cbp60a植株对P. syringae（或者丁香假单胞杆菌）的生长有抑制作用。A、Pma ES4326；B、CBP60A-1由CBP60A；C、PTO DC3000回补；D，DC3000 AVRRPT2。接种野生型col-0、cpb60a-1、cbp60a-2、cbp60b、cbp60c、cbp60d、cbp60e、cbp60f、comp 1（回补株系cbp60a-1:CBP60a ha 1）、comp 2（独立补体系cbp60a-1:CBP60a ha 2）和pad4植物后，立即测定细菌滴度。数据是在两个（a和b）或三个（c和d）独立实验中获得的，每个实验都有四个（第0天）或12个（第3天）生物重复，并结合混合线性模型。误差线表示SE，星号表示与col-0比较为Q,lt;0.05。cfu, 菌落形成单位。

cbp60a对Pma ES4326生长的影响不依赖于CBP60g, 但与cbp60g相似，但与sard1具有累加效应

为了探讨三个CBP60家族成员对植物免疫的影响，我们构建了三个双突变体和一个突变体，并比较了所有cbp60基因型和哥伦比亚（col-0）野生型植物中Pma ES4326的生长情况。图2显示，cbp60a单个突变体显示生长减少，而cbp60g和sard1突变体则显示生长增加，与图1和以前的结果一致（Wang等人，2009、2011）。有趣的是，Pma ES4326在cbp60a cbp60g双突变体体内的生长低于Col-0，与cbp60a中的生长无法区分。

野生型背景下cbp60g的作用为0.4 log10单位，而cbp60g背景下cbp60a的作用与0不可区分（图2b），表明cbp60a的作用相对cbp60g具有上位性。相反，cbp60a sard1双突变体的生长介于cbp60a和sard1突变体之间。sard1在野生型背景和cbp60a背景中的作用没有显著差异，表明cbp60a和sard1对Pma ES4326的生长具有独立作用（图2c）。cbp60a cbp60g sard1的生长略低于cbp60g sard1。 这些数据与CBP60g对抗CBP60a对免疫的抑制作用所需的观点是一致的，而CBP

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