水牛妊娠早期生物标志物的编码序列克隆及部分序列密码优化后在大肠杆菌中的表达外文翻译资料

 2023-04-05 20:38:21

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水牛妊娠早期生物标志物的编码序列克隆及部分序列密码优化后在大肠杆菌中的表达

摘要 胚胎特异性滋养层细胞分泌的妊娠相关糖蛋白（PAGs）作为反刍动物的生物标志物，被人们广泛接受。水牛体内的PAGs信息有限，需要进一步调查以开发灵敏的同源免疫测定法，用于妊娠早期特异性诊断。因此，本实验旨在鉴定和克隆妊娠早期主要表达的胎盘特异性水牛PAG（buPAG）异构体，通过开发抗血清和检测重组蛋白的免疫反应性来表达这种PAG异构体并验证其抗原性，结果表明，PAG7（buPAG7）是水牛妊娠早期胎盘中的主要异构体。尝试在pcDNA3.3载体和FreeStyle HEK293F宿主中表达完整的天然糖基化蛋白，没有成功，然而从buPAG7非糖基化区域中选出由124个氨基酸组成的部分序列，经密码子优化后可以在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中表达，但表达蛋白产量很低。表达蛋白的抗原性通过兔子体内的成功免疫反应得到证实，表明有可能使用由124个氨基酸（aa）组成的部分PAG7蛋白作为假定抗原，用于生产单克隆抗体及开发灵敏的同源免疫测定法。总之，我们的结果证实了buPAG7是早期妊娠中主要的特异性转录本，它的部分124aa序列甚至可以在异源宿主（大肠杆菌）中表达。根据我们在这里提供的数据，预计所表达的重组蛋白可以作为抗原，适用于水牛PAG特异性免疫测定法的发展。

1. 简介

妊娠相关糖蛋白（PAGs）是由基因复制产生的蛋白质，有多种异构体，可能是由母胎结合处的持续选择压力所致，它们是单核和双核滋养层细胞的产物，在牛、水牛、猪、骆驼、野鹿和野牛的胎盘中得到鉴定，通过细胞外分泌释放，可用于母体循环，还可以用于反刍动物妊娠早期的免疫检测。文献报道了牛中约100个PAG基因和其它反刍动物中51个编码PAG的转录本。异构体的变化，不同物种及其妊娠阶段的表达方式，以及与血清蛋白酶的序列相似性增加了这种蛋白质的复杂性，并增加了物种特异性免疫检测的挑战，由于这些原因，PAG检测对异源和普通反刍动物的测定可能不太敏感。一个特异的、灵敏的、准确的免疫测定需要一个同源抗原以培养100%交叉反应抗体。水牛的NCBl/UniProtKB/TrEMBL数据库中大约有22条PAG mRNA序列，但关于妊娠阶段中不同异构体表达模式的信息有限，需要进一步调查，这些信息对开发水牛妊娠早期特异性诊断方法至关重要。水牛PAG已通过常规色谱法纯化，并被用作异源放射免疫分析设计的标准品，也可用于分析妊娠期母体血液中逐月分泌的PAG。根据水牛PAG1、PAG2、PAG7和其他异构体推导的氨基酸序列进行3D结构预测，以了解它们的结构特性和功能作用。目前已有文献表明，PAG7是水牛妊娠早期的胎盘中最主要的特异性异构体，但是完整的编码序列没有报道。

通过常规色谱法纯化早期妊娠特异性PAG异构体不可行，因为纯化所需异构体可能需要大量的起始组织，多个新鲜的早期妊娠胎盘只能通过牺牲怀孕动物获得，伦理上和技术上都是不允许的。胎盘从多个来源汇集，由于它们不同的生化特性，所需异构体不能从来源组织中得到纯化，但是可以从毫克量的组织中鉴定特定的异构体转录物，然后在合适的宿主细胞中克隆并生产重组蛋白。

使用天然糖基化PAG作为抗原对于培养特异性抗体至关重要，这是因为抗原呈递细胞中的MHC分子（更确切地说是Ⅱ类）会将抗原呈递给T细胞识别，天然蛋白质结构的任何改变都导致产生反应性和特异性较低的抗体。电子表位预测显示，蛋白质的糖基化区域通常是亲水的，并且含有免疫优势表位，然而抗原表位可能存在于蛋白质的非糖基化区域，它们可以作为抗体生产的靶点。因此，本实验旨在所有异构体序列中确定水牛主要PAG异构体的编码序列，需要克隆这些异构体的开放阅读框（ORFs）并进行测序，经过密码子优化，将PCR产物的部分序列在大肠杆菌中表达，重组蛋白用于制备抗血清，并通过重组蛋白与抗血清的免疫反应性检测其抗原性。

2. 材料和方法

2.1. 化学品

实验中使用的所有化学品都为分析级，如果未披露来源，则购自Sisco研究实验室（SRL）或印度孟买HiMedia实验室。

2.2. 生物安全审查

本研究的所有方法均经过必要批准，并遵循印度新德里生物技术部和印度班加罗尔ICAR国家动物营养与生理研究所的相关准则和规定。

2.3. 组织收集

等水牛屠宰后立即从当地屠宰场（印度，卡纳塔克邦，班加罗尔公司的屠宰场）收集从卵巢到子宫颈的整个生殖道，将其置于冰上带到实验室。子宫角的外观（对称性/不对称性）通过目测和手触诊来确认，并对卵巢中的黄体进行检查和分离，按照已公布的方法评估其形态学特征。用剪刀剪开子宫角，观察有无胚胎（胎儿和胎盘）、病变和病理结构。妊娠是由胚胎出现来确认的，将整个胎儿从孕体中分离出，使用Soliman等人的公式测量冠-臀长度，以大致确定妊娠日期。采集组织样本，通过卵巢表面黄体的存在来确定黄体期，采取必要的预防措施，以确保样本来自对称子宫角且无病理损伤的生殖道样本。从黄体期非妊娠动物的子宫内膜（n=3）、妊娠动物的肉阜（约第55-67天）（n=3）和胎盘子叶（n=3）中收集约100mg的组织，4℃保存在RNA-later中过夜，后在-80℃长期储存。

2.4. 总RNA分离和cDNA合成

使用RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen，德国）从每个样本的50mg组织中分离总RNA，并使用不含RNA酶的DNA酶组（Qiagen，德国）逐步进行柱内DNA酶消化以去除DNA。用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计（Thermo Scientifictrade;，美国）估算总RNA数量，在1X MOPS 3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲液中，用1mu;g总RNA通过琼脂糖（1%）凝胶电泳进行质量检测。

按照制造商的说明，使用Revert AidTM H minus第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国），从每个样品中取出2mu;g总RNA来合成单链cDNA。

2.5. 水牛主要PAG的PCR扩增、克隆和测序

从肉阜（妊娠和非妊娠动物）和子叶（妊娠动物）中分离RNA合成cDNA样本，对所有cDNA样本都进行了筛选，以确定之前报道的所有水牛PAG中开放阅读框的存在。这是在20mu;L反应体积中，用一个固定的单正向引物（L）和四种不同的反向引物R1-4进行PCR扩增来完成的[补充表1]。每个反应混合物含有20ng的cDNA模板、2X主混合物、5mu;M正向和反向引物（Promega，美国）。扩增条件设定为94℃预变性2分钟，35个循环内变性（94℃ 30秒）、退火（55℃ 30秒）和延伸（72℃ 90秒），最后72℃延伸5分钟。一旦确定了主要PCR产物，就使用校对Accuzyme DNA聚合酶（Bioline，USA，2.5 U/mu;L）和同一引物组重复PCR。使用illustraTM GFXTM PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒（GE Healthcare，美国）对黄体期非妊娠水牛的肉阜、妊娠期第55天的子叶和肉阜样品的强PCR条带进行凝胶纯化，并用于pJET1.2/blunt克隆载体的连接。使用One Shotreg; TOP10F E.coli感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，美国）进行连接混合物的转化，在平板和肉汤中加入氨苄青霉素筛选克隆子，通过Miniprep试剂盒（PLN70，Sigma Aldrich，美国）分离克隆质粒，使用特定引物组[见补充表1]通过PCR确认插入物，并从两个方向对产物进行测序。

2.6. 序列的认证和分析

序列数据由NEB cutter进行分析，以鉴定合适的限制性酶和预期片段大小（如果用这些酶消化的话）。质粒在20uL反应体积中被不同的限制性酶（New England Biolabs，英国）消化，即BamH I（R0136S），Bgl II（R0144S），Eag I（R0505S），PmeI（R0560S），Sal I（R0138S）和Xho I （R0146S）。依据电泳确定片段大小，并与NEB cutter生成的预测片段进行比较。通过这种方法得到的序列由NCBI核苷酸BLAST工具进行注释；系统发育相似性由MEGA7测定；编码和翻译氨基酸序列通过NCBI工具获得。通过BCPREDS在线工具筛选出可能存在的长为20个氨基酸的线性表位。

2.7. 水牛PAG在哺乳动物宿主细胞中的表达

通过PCR从pJET1.2-buPAG7载体上扩增出完整编码序列，并整合到pcDNA3.3哺乳动物细胞表达载体上。Invitrogentrade; pcDNAtrade;3.3-TOPOtrade; TA Cloningtrade;试剂盒提供的前10种E. coli感受态细菌，用得到的重组pcDNAtrade;3.3-buPAG7载体进行转化。通过Mini-prep分离质粒，从两个方向进行测序，以确认表达盒的方向和阅读框架。确认的表达盒批量生产，并使用PureLinkreg; HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit（M/s Thermo Fisher Scientific，美国）进行纯化。在悬浮液中培养用T 175烧瓶装置的FreeStyletrade; HEK 293-F（M/s Thermo Fisher Scientific，美国）细胞，并用测试载体或阳性对照物，即一种编码lacZ盒的结构物（M/s Thermo Fisher Scientific，美国）进行转染，还要使用293fectintrade;转染试剂（M/s Thermo Fisher Scientific，美国）。转染48小时后，收集细胞和废液，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。重复三次尝试表达该蛋白质，但每次都未能观察到特定的条带（见结果）。

2.8. 基于PCR引物的部分buPAG密码子优化方法

在克隆的水牛PAG序列中选择一个长372 bp的序列（495-866 bp），并在开始处加入ATG用于表达。使用两组PCR引物尝试修改7个稀有密码子（AGA到CGT，CTA到CTG，CCC到CCG，CGC到CGT，AGA到AGT，AGA到CGT，ATA到ATC）[补充表2]。使用两个不同的引物组进行两个50mu;L PCR反应，每个反应使用50ng模板（pJET1.2-buPAG）、合适的缓冲液和校对Accuzyme DNA聚合酶（2.5 U/mu;L；Sigma Aldrich，美国）。PCR在初始95℃预变性5分钟，后进行35个循环包括95℃变性5秒、55℃退火10秒和72℃延伸10秒，随后用1.5％琼脂糖凝胶分离PCR产物，从凝胶中切下条带，按前面所述步骤进行纯化。将两个反应中纯化的PCR产物作为模板，使用第1组正向引物（PP1-F）和第2组反向引物（PP2-R）进行第二轮PCR，循环条件为95℃预变性5分钟，后35个循环包括95℃变性10秒、55℃退火10秒和72℃延伸10秒。如前所述，最终PCR产物被解析，从凝胶中切除纯化，并使用基因特异性引物进行测序以确认碱基变化。

2.9. pET 28a（ ）载体中PCR产物的亚克隆

确认碱基变化后，将PCR产物插入pET-28a（ ）载体（# 69864-3，Novagen，美国），使用Nde I和Xho I（New England Biolabs Inc，英国）限制性内切酶（RE）在37℃下消化约1mu;g的pET-28a（ ）载体和2mu;g的PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切除特异性条带并进行纯化。使用T4 DNA连接酶（#M0202S，New England Biolabs Inc，英国）将凝胶纯化的50ng载体和19ng插入物（1:5）在16℃下连接过夜，新生成的重组载体被指定为pET-28a（ ）-par.buPAG。重组pET-28a（ ）-par.buPAG载体用于转化One Shotreg; TOP10F化学方法制备的E. coli感受态细菌，并通过在培养基中补充卡那霉素（Kanamacreg;-1000,Macleods Pharmaceuticals Ltd,印度）进行筛选。然后从抗生素选择的克隆子中分离出质粒，通过PCR确认插入，使用载体特异性测序引物，用Sanger链式终止法对筛选出的3个克隆子进行测序，以确认阅读框架和编码序列。

2.10. 部分重组水牛PAG在大肠杆菌中的表达和纯化

用具有正确方向和阅读框架的重组pET-28a（ ）par.buPAG载体转化BL21（DE3）E.coli感受态细胞（#200131，Agilent Technologies，美国），通过氯霉素（Calbio-chem, EMD Biosciences，德国）和卡那霉素抗生素的筛选以培养克隆子，通过1mM异丙基beta;-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（Calbiochem，EMD，Biosciences，德国）诱导大肠杆菌细胞中蛋白质的生产。准备一个未经IPTG诱导的类似培养物作为对照进行测试。细胞和培养基中的蛋白质表达最初由考马斯reg;亮蓝R-250染料染色的15％SDS-PAGE分析凝胶来证实，证实后，在含有cOmpletetrade;蛋白酶抑制剂混合物（Roche Applied Science，德国）的裂解缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，5 %甘油）中收集蛋白质，收集时使用Ni-NTA Superflow Cartridge（# 30721，Qiagen，德国）。简言之，细胞颗粒在NPI-10缓冲液[50mM磷酸钠（NaH2P

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