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 2022-02-06 19:16:38

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由一种合理设计的多功能蛋白，ChiCaSifi，指导的生物过程促进球霰石(CaCO3) 的合成

摘要

生物体可以通过生物过程产生具有独特功能和特性的优雅结构。这些过程中涉及到多种蛋白质。在软体动物壳结构形成的启发下,以矿化蛋白为基础, 设计了一种单一的多功能重组蛋白 ChiCaSifi,简单直接地调节 CaCO3 矿化。ChiCaSifi 含有几丁质结合蛋白 (Chi)、钙结合蛋白 (Ca) 和蚕丝丝素 (Sifi) 的功能域。因此, ChiCaSifi 可以在指导 CaCO3 矿化中发挥多重作用。ChiCaSifi 的表达和纯化得到了实现。研究了 ChiCaSifi与钙和几丁质结合的活性。证明了 ChiCaSifi 对几丁质表面 CaCO3 晶体相形成的影响。ChiCaSifi 的结构变化与其矿化作用有关。这些观察表明, 合理设计的矿化蛋白功能域的蛋白质可以成为材料合成的有效工具。

本研究不仅对天然生物材料的形成有深入的认识, 而且为新型有机–无机复合材料的设计和合成开辟了新的途径。

介绍

在自然界中, 生物体产生的优雅结构具有独特的功能和性能, 如层状有机–无机结构和增强的壳体力学性能, 多孔微球结构和荷叶自洁面, 复杂的纳米结构和蝶翅的结构颜色。科学家们从天然材料的结构或功能中学习, 创造了 '生物启发性材料' 或 '生物启发性功能'。生物过程对功能结构的形成是至关重要的。生物过程通常由许多导致能量或物质转化的生化反应所组成。由于亿万年的进化, 生物矿化已经成为生产生物材料的典型生物过程, 结合了多种层次的复杂形态学, 具有优越的性能, 环境友好型合成和生物相容性。受生物矿化中结构形成过程的启发, 开发一种新的合成技术，并称之为 '生物过程启发合成'。

生物矿化涉及各种蛋白质和有机分子的活动。这些蛋白质或分子作为成矿模板或诱导剂, 以启动核或稳定矿物形态。对单矿化蛋白及其类似物进行了控制和辅助成矿基材料合成的试验。例如, Dodenhof 等人确定了 perlucin 的剪接变体在调节 CaCO3 结晶方面的作用。然而, 单蛋白的贡献仅限于某些矿化阶段。基因组和蛋白质蛋白研究显示, 许多基因和蛋白质必须在 biomineralizaiton 中共同作用。将矿化蛋白与不同的功能结合起来, 构建人工过程可以提高矿化效率, 有利于新材料的设计和合成。虽然这是可行的, 它是不容易模仿生物矿化的混合矿物和蛋白质的简单和直接的方式。原因是个体蛋白质需要不同的工作条件, 并且/或者这些蛋白质可能相互作用并且抑制他们的活动。

碳酸钙 (CaCO3) 作为自然界中最丰富的生物矿物之一, 在生物材料和生物矿化领域得到了相当的重视。许多海洋生物在如此巨大的规模上诱导了 CaCO3 矿化, 从而影响到全球海水化学, 以及地球的大气层和气候。CaCO3的三矿物多晶型已经确定 (方解石、石岩和球霰石), 而单水方解石、六水合物 ikaite 和无定形碳酸钙 (ACC) 或多或少都是碳酸钙的水合形式。CaCO3 生物矿化始于预晶核形成簇的形成。它们的聚集导致了非晶纳米粒子在溶液中的成核。这些纳米粒子组装在模板上, 并在临界尺寸后, 开发出可由模板选择性地稳定的动态晶体域。

通过对软体动物壳结构形成的启发, 本研究旨在利用含有矿化蛋白领域的合理设计的重组蛋白来模拟生物矿化。为指导 CaCO3 矿化, 构建了单一的多功能重组蛋白 ChiCaSifi。对 ChiCaSifi 对 CaCO3 矿化的影响进行了探讨和论证。

实验

重组蛋白的构建、表达及纯化

合成了钙结合域和丝素蛋白重复段的编码序列, 并将其克隆成质粒 pTWIN1 (新英格兰 Biolabs, 美国)。所合成的质粒是 pTWIN (ChiCaSifi) 携带的基因 ChiCaSifi。所有构造均经 DNA 测序证实。

ChiCaSifi 的表达和纯化是基于IMPACTTM-TWIN用户手册。一个单一的携带pTWIN (ChiCaSifi)的大肠杆菌 BL21 (DE3) 接种到 Luria–Bertani (LB) 培养基中，培养基中含有0.1 mg ml-1氨苄青霉素，在37℃摇床中过夜培养。细胞悬浮液接种到LB液体培养基中, 然后在37℃摇床中培养,直到OD600达到0.5-0.6。蛋白表达是通过加入1mM IPTG和持续在37℃摇床中培养3 小时开始的。用6000g，4℃，离心10 分钟获取细菌, 在缓冲液A (20 mM Tris-HCl, pH 8.5; 500 mM NaCl; 0.2% Tween 20; 1 mM EDTA (乙烯二胺四乙酸)) 和裂解。细胞裂解物以12 000g 离心30 分钟, 以去除细胞碎片和进行几丁质亲和层析。几丁质亲和树脂预洗, 平衡。用缓冲液B(20 mM Tris-HCl, pH 8.5; 500 mM NaCl; 1 mM EDTA)洗涤未结合蛋白。已结合蛋白ChiCaSifi 的洗脱是由1% 钠月桂磺酸(SDS)或6 M GuHCl分别和透析依次对缓冲液C (20 mM Tris-HCl, pH 8.5; 500 mM NaCl; 0.2% Tween 20) 2 小时, 缓冲液D(20 mM Tris-HCl, pH 8.5; 500 mM NaCl; 0.1% Tween 20) 为2小时, 和生理盐水(0.9% NaCl) 8小时。

钙结合试验

用钙离子检测 ChiCaSifi 滴定的内在荧光变化, 测定钙离子对 ChiCaSifi 的束缚。ChiCaSifi 的荧光发射记录在310 nm和450 nm之间, 激发波长为 295 nm。

体外成矿作用

体外成矿作用在10 mM NaHCO3 中, 甲壳素和 ChiCaSifi 在室温下存在。通过添加10 mM CaCl2, 对碳酸钙成矿作用进行了初始化。将甲壳素树脂与 CaCO3 矿物一起用离心法收集 1000g 5 分钟。

矿化产物的表征

晶体形态学是用 S4800 (日立公司) 扫描电子显微镜 (SEM) 成像的, 装有场发射源, 运行在5 kV。用 KBr和 Ultima III (利用日本理学公司) x 射线衍射仪与铜 Ka 辐射 (40 kV, 40 mA) 对一个关联 (热费舍尔科学) 傅里叶变换红外光谱仪进行了结晶和非晶相分析。在2y 范围的201–601中采集了 XRD 图谱。

结果与讨论

ChiCaSifi蛋白的设计，表达，纯化

软体动物壳的形成是 CaCO3 生物矿化的典型过程, 涉及成矿蛋白和甲壳素。贝壳的珍珠是由矿物层建造的, 在有机模板上测微晶体的核化和生长。甲壳素和蛋白质 (如钙结合蛋白和丝绸丝素) 构建这些模板, 并生产, 作为分泌物, 由生物体。单个有机基质片由一层薄薄的甲壳素组成, 夹在蛋白质层间。矿物形成外延定向生长在基体表面上。程等人观察到, 丝素的固有聚集影响了 CaCO3 骨料的形态和晶体变形。观察了丝素/甲壳质相互作用及其对 CaCO3 矿化的影响。以甲壳素和蛋白质在软体动物壳 CaCO3 矿化中的作用为灵感, 结合甲壳素结合蛋白 (Chi)、钙结合的功能域, 设计并构建了一种重组多功能蛋白 ChiCaSifi。蛋白质 (钙) 和丝绸丝素 (Sifi)。甲壳素结合域来源于质粒 pTWIN1。改善了 ChiCaSifi 与甲壳素基质的相互作用。甲壳素基质然后作为一个平台, CaCO3 矿物可以生长。钙结合域来源于珍珠牡蛎基质蛋白。它改善了 ChiCaSifi 和钙离子之间的相互作用。丝素的重复段直接影响 CaCO3 骨料的形态和晶体变形。因此, ChiCaSifi 能促进 CaCO3 成矿作用, 成为软体动物壳形成过程中发生的现象。用 webware SOPMA 预测了 ChiCaSifi 的二次结构。结果表明, 甲壳素结合域和钙结合域的显性次生结构为beta;型结构, 蚕丝丝素重复的显性次生结构为盘绕线圈。

存在足够数量的矿化蛋白是生物矿化或 biomimicking 方法制备材料的先决条件。虽然许多生物体能够产生成矿蛋白, 但这些蛋白要么在某些生长阶段合成, 要么在自然体内生物矿化过程中耗尽。在体外蓄意合成生物材料时, 获得足够的矿化蛋白是不容易的。科学家们利用成矿蛋白的化学类似物来控制生物矿物的结晶和形态。然而, 这些类似物的作用仅限于生物矿化的某些阶段。另一种选择是使用原核系统生产完整的矿化蛋白。它也受原核和真核表达系统的显著差异所限制。在本研究中, 我们提出了一种替代策略, 结合不同蛋白质的功能领域, 形成一个单一的多功能蛋白。与全长真核蛋白相比, 原核系统的功能域表达更容易。在这里, 重组蛋白 ChiCaSifi 是通过结合三种不同的蛋白质功能域和过度表达在原核宿主大肠杆菌。ChiCaSifi 的纯化达到了95% 的均匀性。通常, 10 毫克的蛋白质 ChiCaSifi 可以预期从 1 L 大肠杆菌的文化。循环二色谱 (CD) 光谱学表明, 纯化的 ChiCaSifi 保留二次结构, 这在加热时被中断, 椭圆在208 nm和230 nm的变化表明。因此, 将成矿蛋白的功能域与遗传水平相结合, 形成多功能蛋白质, 对于获得足够数量的蛋白质进行材料合成是有效的。

多功能蛋白 ChiCaSifi 的生物活性研究

ChiCaSifi 被设计成具有结合甲壳素和钙的生物活性。用甲壳素亲和层析法纯化 ChiCaSifi 的甲壳素结合活性。当含有 ChiCaSifi 和其他细胞质蛋白的细胞裂解与甲壳素树脂混合时, 只有 ChiCaSifi 与甲壳素树脂结合, 随后洗脱 (Fig. 1B)。其他蛋白质没有陈列捆绑的活动对甲壳素。纯化 ChiCaSifi 仍保留了甲壳素的结合活性(ESI,dagger; Fig. S3)。

ChiCaSifi 和甲壳素之间的相互作用通过 FTIR 光谱证实了1600和 1700cm-1的蛋白质酰胺 I 吸光度的特性。酰胺 I 波段可以 deconvoluted 和分配到蛋白质的二级结构, 即在 1633 cm-1, 1642 cm-1, 1691 cm-1 为 beta 型结构, 在1656 cm-1 为alpha;螺旋, 并在 1648 cm-1 为随机线圈. 32, 因为甲壳素也展出了 IR absorbance 在 1632 cm-1和 1659 cm-1, 不容易量化的二级结构组成的 ChiCaSifi 后, 结合到甲壳素。然而, ChiCaSifi 的结构信息仍然是明证 (图 2A)。吸光度峰值在 1643 cm-1, 1690 cm-1, 1649 cm-1。这些吸收峰值与beta;型结构和随机线圈有关, 如从氨基酸序列分析中预测的 (图 1A)。

用钙离子滴定测定 ChiCaSifi 的钙结合活性, 并测量其内在荧光变化 (图 2B)。当钙浓度从0 mM增加到0.14 mM时, 观察到荧光猝灭。用 Stokes–Einstein 关系的公式计算了荧光猝灭常数。通常, 生物分子与淬火之间的非特异性碰撞所引起的最大淬火常数为 2.0 *1010 L mol-1S-1。在本研究中, 346.5 nm 波长的荧光猝灭常数计算为 9.85*1011 L mol-1S-1, 这意味着 ChiCaSifi 的静态荧光猝灭是由于与钙离子的特异结合。

ChiCaSifi 碳酸钙矿化作用的辅助作用

探讨了 ChiCaSifi 和甲壳素存在下的 CaCO3 成矿作用, 并与无 ChiCaSifi 和/或甲壳素相比较。没有任何添加剂, 方解石相形成12小时 (图3A 和 D)。添加甲壳素时, 菱面体的对称性仍然是甲壳素表面唯一的晶相 (图3B 和 D)。这表明甲壳素对方解石形态没有直接的影响。在 ChiCaSifi 和甲壳素的存在下, 观察到球霰石的形成, 尽管还有一些方解石晶体。CaCO3 形态的微妙转变发生在球霰石晶体的球形骨料 (图 3 C1–C3 和 D) 上。球霰石对方解石的比例与 ChiCaSifi 的百分比有关。当 ChiCaSifi 浓度从 0.1% (w/w) 增加到 2% (w/w) 时, 球霰石成为主导阶段, 只有一个方解石的踪迹 (图 3D)。在 2% (w/w) ChiCaSifi 的存在下, 发现巨型球形骨料由纳米晶亚基组成 (图 3C)。结果表明, 设计的 ChiCaSifi 蛋白在 CaCO3 结晶过程中能起到重要作用, 球霰石是 ChiCaSifi 控制下的首选相。

CaCO3 的溶解通常与 pH 值 CO3 2 和 HCO3 之间的平衡有关。监测 ChiCaSifi 在不同 pH 值存在下的成矿作用, 了解 CaCO3 沉淀的机理 (图 4)。研究发现, 在 pH 值为 8.5 (图 4B) 的情况下, 大量的球形球霰石 CaCO3 出现。当 pH 值从8.5 降至7.5 时, 球霰石的溶解表明从 CO3 2 到 HCO3 的转化可能是溶解的驱动力之一 (图 4A)。当 pH 值从8.5 增加到9.5 时, 由于溶液中高浓度的 CO3 2, CaCO3 的结晶加速, ChiCaSifi 对 CaCO3 成矿作用太快, 导致菱面体方解石形成为预期 (图 4C)。这些观察表明, 8.5 是 ChiCaSifi 控制下球霰石形成的最佳 pH 值。

探讨了 ChiCaSifi 生物矿化 CaCO3 的时间过程, 了解多功能蛋白在生物矿化中的作用。观察 CaCO3 生物矿物

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