氟嗪胺对菌核病形态生理特性的影响外文翻译资料

 2022-02-14 20:35:30

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氟嗪胺对菌核病形态生理特性的影响

摘要 菌核病是一种坏死性丝状真菌，寄主范围广。氟嗪胺是一种具有广谱抗菌活性的吡啶胺类杀菌剂，对菌丝体菌核菌群的生长有较强的抑制作用。但氟嗪胺对菌核菌形态和生理特性的影响尚不清楚。在本研究中，三株菌核菌（CZ17S、YZ55S、SA42S）对氟拉嗪的EC50值分别为0.0084、0.007、0.0065mu;g/mL。氟哌嗪处理后菌丝变薄，菌丝顶端分支增多，菌丝与菌丝间距离增大，隔膜和隔膜变短，细胞膜通透性明显增加，胞外多糖（eps）含量和草酸含量显著下降，过氧化物酶（POD）活性显著升高，且抑制了菌丝呼吸。菌核数和干重、菌丝中甘油含量没有明显变化。在离体菜籽叶片保护活性测定中，氟嗪胺的应用40mu;g/mL和80mu;g/mL，控制效果分别达到41.4%和100%。在疗效分析中，应用氟拉嗪100mu;g/mL，控制效果达到61.09%。在相同浓度下，氟拉嗪对菌核病的保护作用高于疗效。这些结果将有助于评价杀菌剂氟嗪胺在菌核病干腐病防治中的应用潜力，了解氟拉嗪对菌核病的作用方式。

关键词 氟啶胺，形态学，生物学特性，油菜菌核病菌

1介绍

丝状子囊菌菌核病（lib.）de bary是一种重要的植物病原菌，寄主范围广，分布广泛。75科至少有400种植物物种易受这种病原体的影响，包括许多重要的农作物和杂草，例如油菜、大豆、甜菜、向日葵、花椰菜、番茄、花生等（Bolton等人，2006年；Di等人，2016年；Guyon等人，2014年；Kamvar等人，2017年；Kaushall等人，2017年；Li等人，2017年；Li等人，2017年；U等人，2017年；Sun等人，2017年）。菌核病干腐病（SSR）是由菌核病引起的，在包括美国、加拿大、澳大利亚和中国的许多国家，对一些重要的蔬菜作物造成严重的产量和质量损失（Bradley和Donald，1984；Lee等人，2015；Letham等人，1976；Liang等人，2018）。在中国，它发生在所有的油菜籽种植区，特别是在长江地区和中国东部的江苏省。在中国江苏省，SSR每年造成5%至80%的产量损失，并降低油籽油菜的质量（Firoz等人，2016；Maet al.，2009；Xu等人，2013；Zhao和Meng，2003）。

为了控制SSR，杀菌剂在过去几十年中在中国得到了广泛应用（Kurt等人，2011；Xu等人，2014；Steadman，1979）。杀菌剂多菌灵（苯并咪唑类杀菌剂）抑制了植物病原菌的细胞分裂，并在中国近40年来广泛应用于控制SSR。不幸的是，自20世纪90年代末以来，人们报告了对多菌灵的高度抵抗（Kuang等人，2011年；Liang等人，2015年）。杀菌剂二甲氧基己酮（二卡西姆类杀菌剂）是中国十年多以来广泛用于控制SSR的另一种杀菌剂（Liang等人，2015）。由于近年来二聚体酮的大量使用和气候变化，我国已报道了抗二聚体酮的分离株（齐等，2006；张等，2003）。近年来，江苏省报告了低水平的对二聚体的耐药性（Ma等人，2009年），山西省、湖南省和黑龙江省报告了中高水平的对二聚体的耐药性。因此，对不同作用方式的新型杀菌剂进行有效评价是控制SSR的必要条件。

二硝基苯胺类杀菌剂氟嗪[3-氯-N-（3-氯-5-三氟-甲基-2-吡啶基）-alpha;，alpha;，alpha;-三氟-2，6-二硝基-p-甲苯胺]是一种预防性杀菌剂，具有高效的杀菌剂和独特的活性。其分子式为C13H4Cl2F6N4O4，其结构式如图1所示。氟嗪胺可以通过解偶联氧化磷酸化来中断真菌细胞的能量生产过程（ATP的合成）（Johnson和Atallah，2006年；Vitoratos，2014年）。氟嗪胺首先由环境保护署（EPA）登记用于农业用途。在澳大利亚，氟拉嗪已应用于控制草莓果实腐烂、葡萄藤炭疽和根肿病（Magarey等人，1993年；Porter等人，1998年；Washington等人，1992年）。在巴西和欧洲，氟嗪胺被用于控制马铃薯和豆类的疾病（Hu等人，2005年；Smith等人，1992年）。在北卡罗莱纳州，氟拉嗪被用于控制花生的菌核病（由轻微菌核病引起）（Lemay等人，2002年）。在中国，fluazinam已注册用于控制马铃薯晚疫病、马铃薯早疫病、辣椒疫霉病、辣椒炭疽病、苹果褐斑病和大白菜根肿病（lemay等人，2002年；liu，2012年；matheron和porchas，2004年；porter等人，1998年；suzuki等人，1995年；washington等人，1992年）。

先前的研究表明，氟哌嗪对菌核菌的体外菌丝生长有很强的影响（Liang等人，2015；Mao等人，2018；Wang等人，2016）。但是，氟哌嗪对菌核菌形态和生理特性的影响尚不清楚。为了进一步揭示氟拉嗪的作用机理，我们研究了氟拉嗪对核盘菌形态和生理特性的影响。因此，本研究的目的是：（a）测定氟拉嗪对油菜菌核形态的影响；（b）研究氟拉嗪对油菜菌核生理的影响；（c）测定氟拉嗪对油菜叶片菌核的保护作用和疗效。这为菌核病引起的SSR的治疗提供了新的参考数据，将有助于我们进一步了解氟拉嗪对菌核病及其他植物病原菌的作用方式。

2 材料与方法

2.1培养基、杀菌剂和菌株

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基由200 g马铃薯、20 g葡萄糖和16 g琼脂/升蒸馏水制成。Yepd液体培养基由0.3%（w/v）酵母提取物、1%蛋白胨、2%葡萄糖/升蒸馏水制成。

氟嗪胺（有效成分97%）由江苏蓝峰生化有限公司提供，溶于甲醇，得10 mg/ml储备液。甲醇浓度从未超过试验溶液的0.1%。根据需要稀释溶液，并在黑暗中4°C下储存。市场采购的氟嗪类悬浮剂。

本研究于2017年从中国江苏省不同地理油菜田采集了5株菌核菌CZ17S、YZ55S、SA42S、SY7S和TZ84S。

2.2对氟嗪的敏感性

用三株菌核菌CZ17S、YZ55S和SA42S进行了氟嗪敏试验。将每个菌株2天龄菌落边缘的菌丝塞（直径5 mm）转移到pda平板上，分别用0、0.0015625、0.003125、0.00625、0.0125、0.025和0.05mu;g/ml氟嗪胺进行修正。每种浓度进行三次复制。在黑暗中25℃培养48小时后测量菌落的直径（减去接种塞的直径）。根据对数转化杀菌剂浓度上菌落直径的线性回归计算出有效浓度中值（EC50）（周等，2016）。实验进行了三次。

2.3氟哌嗪对菌核菌菌丝形态的影响

用三株菌核菌CZ17S、YZ55S和SA42S进行菌丝形态测定。将活跃生长菌落前缘的菌丝塞（直径5 mm）转移到含有1 ml pda培养基的载玻片上，用0.05mu;g/ml氟嗪进行修正。对照组采用无氟嗪的载玻片。在25℃培养12小时后，用含钙白色（cfw，1mu;g/ml）的溶液对菌丝体进行染色，用光学显微镜观察菌丝体顶端的形态（日本奥林巴斯IX-71）。每次治疗有三次重复，实验重复三次。

2.4氟哌嗪对核盘菌产核的影响

用5株菌核菌CZ17S、YZ55S、SA42S、SY7S和TZ84S进行菌核生产。将2天龄菌落边缘的菌丝塞分别转移到含0.0039、0.0078、0.015、0.05和0.1mu;g/ml氟嗪胺的pda平板上。用不含氟嗪的平板作对照。所有培养皿在25°C的培养箱中培养30天，测量并称重每个菌落的菌核产量。每个菌株有三个PDA平板复制，实验重复三次。

2.5氟拉嗪对菌核菌胞外多糖含量的影响

用三株菌核菌CZ17S、YZ55S和SA42S进行胞外多糖（EPS）测定。通过先前描述的方法对每个菌株产生的EPS数量进行了测试，并进行了一些修改（Dubois等人，1956；Rao和Pattabiraman，1989）。为了制备EPS标准曲线，反应混合物由2 ml葡萄糖溶液（0、20、40、60、80、100、120、160和200mu;g/ml）、1 ml 5%苯酚溶液和5 ml浓硫酸、旋涡2或10 s组成，在25°C下培养30分钟。在490 nm下测量溶液的吸光度。在这种情况下，吸光度越大，葡萄糖浓度越高。根据葡萄糖浓度绘制吸光度，生成标准曲线。

将PDA上2天龄菌落边缘的菌丝塞（直径5 mm）转移到250 ml烧瓶（每个烧瓶5个塞子）中，其中含有100 ml yepd。将烧瓶放置在旋转摇床上（25°C时为175 rpm）。36小时后，用氟嗪胺以0.05mu;g/ml的极限浓度对部分烧瓶进行修正。再摇动烧瓶36小时。内容物以10000 rpm离心20分钟，并收集上清液。用三体积的无水乙醇从每毫升上清液中沉淀EPS，然后干燥。将EPS溶于8ml蒸馏水中，用标准曲线定量。以无菌蒸馏水作为对照。每种治疗有三次重复，试验重复三次。

2.6 氟嗪胺对核盘菌过氧化物酶（POD）活性的影响

菌丝体的制备如第2.5节所述。将菌丝体（每个样品0.5 g）用含有10 ml 100 mM磷酸钠缓冲液（ph 5.5）和0.1 g聚乙烯吡咯烷酮（pvpp）的冷萃取缓冲液均质，以测定POD活性。提取液在4°C下以27000转/分的速度离心30分钟。上清液用于酶分析。

根据Jiang等人的描述进行POD。（2002）做了一些修改。反应混合物由3 ml愈创木酚底物（100 mM磷酸钠缓冲液，pH5.5和50 mM愈创木酚）和1 ml酶提取物组成，在37°C下培养15分钟。加入30mu;L H2O2后，测定470 nm处的吸光度增加。酶活性的一个单位被定义为每分钟吸收率的一个变化。

2.7氟哌嗪对核盘菌草酸含量的影响

草酸含量根据之前的研究进行测量，并进行了一些修改（Duan，2007；Duan等人，2013）。采用三株菌核菌CZ17S、YZ55S和SA42S进行草酸含量测定。简单地说，将每株菌株2天龄菌落边缘的5个菌丝塞转移到250毫升装有100毫升yepd的烧瓶中，用0.05mu;g/ml的fluazinam对其进行修正，并将不含fluazinam的处理作为对照。将烧瓶在175转/分和25°C下摇动4天后，以1500转/分的速度离心10分钟，并使用微孔板（美国Versamax分子装置）在510 nm处测量上清液中草酸含量的吸光度值。根据标准曲线计算菌丝体草酸含量。每个菌株有三次重复，实验进行了三次。

2.8氟哌嗪对核盘菌细胞膜通透性的影响

本试验采用三株CZ17S、YZ55S和SA42S菌株，将两天龄菌落边缘的五个菌丝塞（直径5 mm）加入含有100 ml yepd的250 ml三角瓶中，并在旋转摇床中以175 rpm的速度摇动。将烧瓶在175转/分和25°C下摇动36小时后，以0.05mu;g/ml的极限浓度补充部分烧瓶中的氟嗪。对照品为不含氟嗪的烧瓶。摇瓶36小时后，用三张镜片纸收集菌丝，用双蒸馏水洗涤三次。在真空中过滤20分钟，将0.3 g菌丝悬浮在20 ml双蒸馏水中。0、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160和180分钟后，用电导率仪（Con510 Eutech/Oakton，Singapore）测量双蒸馏水的电导率，以评估细胞膜对细胞内容物的浸出程度。3小时后，将含有菌丝体的水煮沸5分钟，测量最终电导率。菌丝体的相对电导率计算为：相对电导率（%）=电导率/最终电导率times;100。每次治疗有三次重复，实验重复三次。

2.9氟哌嗪对核盘菌甘油含量的影响

根据先前的研究，采用甘油酸铜比色法测定菌丝体中的甘油含量（Yan和邱，2004）。为了制备甘油标准曲线，反应混合物由10 ml甘油溶液（0，0.0003125，0.000625，0.00125，0.0025和0.005 g/ml）、1 ml 0.05 g/ml CuSO4溶液和3.5 ml 0.05 g/ml NaOH溶液组成。将混合溶液置于旋转摇床（100转/分）上12分钟，并通过灭菌透镜纸过滤混合溶液。使用微孔板（美国Versamax分子装置）在630 nm下测量甘油酸铜的吸光度。甘油酸铜的吸光度随甘油浓度的增加而增大。

本试验使用了三株CZ17S、YZ55S和SA42S菌株，菌丝体的制备如第2.5节所述。将每个样品的菌丝体（0.5 g）在液氮中研磨，转移到含有20 ml无菌蒸馏水的50 ml烧瓶中，在80°C下加热15分钟，然后以8000转/分的速度离心10分钟。上清液用标准曲线进行甘油含量测定。每个菌株有三次重复，实验进行了三次。

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