葡萄多毛根系培养优化及白藜芦醇
生产研究
--Sayed Mehdi Hosseini1·Bahman Bahramnejad1·Hamed DouletiBaneh3·Aryo Emamifar2·Paul H. Goodwin4
Springer Science Business Media Dordrecht
摘要：白藜芦醇是一种葡萄中含量极低的多酚类化合物。为了在野生葡萄中获得高产率的白藜芦醇，感染体外培养的葡萄（Vitis vinifera）亚种的节间，节点或叶柄，使用三种发根土壤杆菌菌株Ar318，ArA4和LBA9402诱导毛状根。采用sylvesteris种质W2和W16，以及品种Rasha。考察接种时间，外植体年龄，细菌浓度和共培养时间对毛状根生产效率的影响。菌株Ar318，ArA4和LBA9402均在测试的基因型中诱导毛状根，但ArA4菌株的效率高于其他菌株。毛状根生产最高的是使用节间作为外植体。通过PCR检测rolB基因证实毛状根系的转化。与MS培养基相比，半Murashige and Skoog（MS）培养基更适合生物量生产。在毛状根培养物中白藜芦醇产生的HPLC分析显示，所有基因型比对照根产生更高量的白藜芦醇。在W16节间培养物中产生最高量的白藜芦醇，其比对照根高31倍。此外，TLC 分析结果表明，用醋酸钠和茉莉酸盐处理毛状根可提高毛状根组织中白藜芦醇的含量，并将白藜芦醇排泄到半MS培养基中。这些结果表明，内源性和外源性因素均可影响葡萄毛状根部培养白藜芦醇的产量，该策略可用于提高葡萄低白藜芦醇产量。
关键词：毛状根；葡萄；白藜芦醇；HPLC；薄层析色谱；激发剂
1 简介
Stilbenes是Vitaceae中的一小部分植物次生代谢物，其受各种生物和非生物胁迫而积累（Schnee等人，2008），一种是白藜芦醇(三，五，四-三羟基-反式芪)，这是植物抗病抵抗的一种多酚类植物抗病毒素(兰吉饼和普赖斯1977)。白藜芦醇的另一个主要作用是它的药理学特性，它有抗氧化，抗癌，反心血管和抗神经退行性行为(De La Lastra和Villegas 2005)。
白藜芦醇可以在葡萄、花生、可可和蓝莓等多种植物中合成，但葡萄是白藜芦醇的主要膳食来源(Jeandet et al.)。2002)。白藜芦醇是在真菌感染、紫外线照射、臭氧胁迫、缺氧治疗和创伤作用下合成的(Fritzemeier and Kindl 1981;Jeandet et al。2002;Wang et al. 2010)。然而，如果没有这些应力，白藜芦醇的浓度就很低，组成水平为0.2 ~ 16.5 mg/kg FW。在茎、辅助芽、芽尖、叶柄、根和叶在茎韧皮部和叶中的含量分别为最高和最低(Wang et al.)。2010)。
次生代谢产物在不同的V. vinifera基因型中积累不同。例如，野生美国葡萄，Vitis rotundifolia，主要积累二糖苷花青素，而V. vinifera subsp专门积累单糖苷花青素（Narduzzi等，2015）。 气相色谱 - 质谱法分析由V. rotundifolia产生的葡萄酒中的酚酸，醇，芪和黄酮类化合物，揭示了比V. vinifera亚种更有多种化合物对人类健康有益的作用。 vinifera cvs。 Mavrud，Cabernet Sauvignon和Merlot（Dincheva等人2011）。大多数野生葡萄（Vitis quinquan-gularis）中的白藜芦醇含量显着高于大多数葡萄（Vitis quinquan-gularis）。 vinifera栽培品种（Shi et al.2014）和日本野生葡萄（Vitis ficifolia cv.Ganebu）具有相对高水平的白藜芦醇产量（Shiozaki等人，2012）。
结果表明,在伊朗，野生葡萄，V. vinifera subsp,常见于阿尔伯茨和扎格罗斯的潮湿地区山(Sabeti 1976)。根据形态学特征和分子数据，该亚种表现出相当大的遗传多样性(Doulaty 等， 2007)。V. vinifera subsp. sylvestris 和cultivated V. vinifera subsp. Vinifera主要的不同是：vinifera是指野生葡萄是雌雄同株的，而栽培葡萄是雌雄同株的，具有两性花(即双性花，花具子房和花药)，这可能是驯化过程中选择的(Ibrahim和Bayir 2010)。结果表明，葡萄无性系种群Rasha是一个重要的品种，主要种植在伊朗的西北部和西部。Rasha与野生葡萄在颜色、形状等果实特性上非常相似，是雌雄同体的，开双性花，如V. vinifera subsp。vinifera (Doulaty等)。2007)。
因为它的医学意义，人们尝试从植物中增加白藜芦醇的产量。例如，来自V.vinifera亚种的葡萄芪合酶基因的转基因葡萄中大量表达，白藜芦醇积累增加5至100倍。欧洲葡萄（Coutos-Theacute;venot等人，2001），和中国野生葡萄芪合酶6基因大量表达，为转基因葡萄5.5倍，Vitis pseudorculitis（Fan et al，2008）。Cantos等（2002）表明，在非转基因植物中，在4°C下储存葡萄与UVC和UVB光处理相结合，白藜芦醇的含量增加了两倍。增加白藜芦醇含量的另一种可能方法是使用植物细胞培养物。获得增殖植物细胞培养物的一种方法是通过发根土壤杆菌感染诱导毛状根，并且毛状根已被用于产生多种次生植物代谢物，例如人参中的人参皂甙，玫瑰喜树中的长春碱和长春新碱，水母雪莲中的jace-osidin (Tian 2015)。
发根农杆菌是一种土生革兰氏阴性植物病原菌，通过将其转移DNA (T-DNA)进入宿主基因组而诱导毛状根。T-DNA位于一种叫做根诱导质粒(pRi)的大型细菌质粒上，一旦T-DNA整合到宿主基因组中，它就会指挥生长素的合成，引发毛状根的生长(Chandra and Chandra 2011)。一些活跃在植物气生部位的植物生物合成途径在根系中不活跃，但毛状根系可以积累代谢产物，如黄花蒿中的artimisin和黄花蒿中的lawsone，这些代谢产物通常只在植物气生部位产生(Bakkali et al. 1997;Weathers等，1997)。因此，毛状根具有增加植物次生产物数量和种类的潜力。
鉴于健康葡萄中白藜芦醇的含量较低，且需要大规模生产，因此应制定新战略以增加其产量。实现这一目标的一个有希望的方法是体外生产。为了达到这一目的，我们用3株根瘤菌(ArA4, Ar318, LAB9402)诱导毛状根的产生，并增加了2个V. vin-ifera subsp的白藜芦醇含量。sylvesteris和V. vinifera subsp。此外，还研究了外植体类型、苗龄、接种菌剂浓度和接种时间等因素对毛状根形成效率的影响。
2 材料和方法
2.1 植物材料
从伊朗Sanandaj的库尔德斯坦大学中获得葡萄无性系种群sylvesteris种质W2和W16和cv．Rasha。将插条转移到实验室并用70％乙醇和0.8％次氯酸钠灭菌。 然后在Murashige and Skoog（MS）和具有30g / l蔗糖，1mg / l苄氨基嘌呤（BAP）和7g / l琼脂的半强度MS培养基上培养插条。将培养基的pH调节至5.8，并将培养物保持在25plusmn;2℃，60％湿度和16：8h（光照：黑暗）的生长室中。4周后，从幼苗的节点，节间和叶柄取样用于接种。
2.2 农杆菌属rhizogenes菌株
将3株A.根瘤菌Ar318、ArA4和LBA9402分别在液体LB培养基中添加50 mg/l卡那霉素(德国慕尼黑Sigma-Aldrich)和100 mg/l利福平(德国慕尼黑Sigma-Aldrich，德国)摇晃(180 rpm)48 h 28°C。用LB培养基将细胞密度调整为0.6-1.0的OD600。提高转换效率,acetosyringone(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)添加在最后100mu;M接种前的浓度。
2.3 毛状根诱导
通过用三种浓度的细菌悬浮液之一（OD600为0.6,0.8或1.0）浸泡节点，节间或叶柄10,20或30分钟而不摇动来进行接种。然后将外植体风干并转移到不含激素的MS培养基中，并在黑暗中于25plusmn;2℃温育。24,48和72小时后，将外植体转移到含有500mg / l头孢噻肟的MS培养基中以除去土壤杆菌，并且每2-4天重复一次，直到不能检测到土壤杆菌。为了检查外植体中细菌的消除，将随机选择的根在LB液体中在28℃下以180rpm振荡培养48小时，然后铺在固体LB培养基上。对照外植体未接种和培养，类似于接种的外植体。测量毛状根的出现，毛状根的数量和每个外植体的毛状根的长度。对于毛状根长和毛状根数，在细菌接种后30天从三次独立测量中收集数据。
在毛状根出现后，切除离根尖4-5cm并置于含有50ml含有300mg cefo-taxime的半MS MS液体培养基的250ml烧瓶中，然后在25plusmn;2℃，16：8h孵育。（光照：黑暗）以90转/分的速度振荡。为了比较天然根与毛状根的生长速率，在相同条件下培育野生型根。培养基每2周更换一次。如先前对外植体所述检查毛状根的土壤杆菌污染。
2.4 转基因毛状根的确证
使用Doyle（1987）的CTAB方案提取来自根和毛状根系的基因组DNA。使用rolB基因特异性引物[5ATG GAT CCC AAA TTG CTA TTC CCC ACGA-3和5TTA GGC TTC TTT CAT TCG GTT TAC TGC AGC -3（Khalili等人2009）]进行毛状根的确认。用含有200ng植物基因组DNA或10ng Ri质粒DNA作为阳性对照和0.4mu;M每种引物的Cinnagen master mix（Cinnagen，Teh-ran，Iran）进行反应。 rolB扩增的条件是在95℃下初始变性5分钟，然后进行35个循环的扩增（95℃30秒，60℃30秒和72℃1分钟）和10分钟延伸。 72°C。 在1％琼脂糖凝胶中电泳后可见PCR扩增子。
2.5 比较培养基对毛状根增殖的影响
将源自发根农杆菌菌株ArA4（品系W16A4-1）和野生型对照的登记号W16的节间的毛状根系在MS和半MS培养基中以90rpm在25plusmn;2℃下振荡培养16 ：8小时（光照：黑暗），在10天，20天和30天测量根部质量。该实验重复三次。
2.6 量化的白藜芦醇
在30天收集毛状根，并将新鲜样品储存在-80℃直至使用它们。将收集的样品在室温下干燥。使用研钵和研杵将根研磨成细粉。根据Soleas等人的方法从毛状根中提取白藜芦醇。 （1995）和Bavaresco等（1997年）略有修改。将粉状毛状根（100mg）加入到600mu;l甲醇（HPLC级，Merck，Darm-stadt，Germany）中并搅拌30分钟。然后将混合物以1970times;g离心（Hettich，Tuttlingen，Germany）4分钟并除去上清液。将粉末状根的提取重复三次，合并甲醇提取物。将其通过0.45mu;m过滤器（Schleicher和Schuell，Keene，USA），然后将20mu;l注入到BFRL SY中的Venusil MP C18柱（4/6 mmtimes;250 mm; Agela Technologies，Tianjin，China）中。-8100 HPLC（北京北芬瑞丽分析仪器有限公司，中国北京）。通过注射已知量的反式 - 藜芦醇1（Sigma-Aldrich，Budapest，Hungary）测定白藜芦醇的量。
2.7 诱导剂处理和TLC分析培养基和毛状根中的白藜芦醇
12天龄品系W16A4-1的样品在含有100mM茉莉酸甲酯（Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，Germany）的半MS培养基中生长12小时或10.2mM乙酸钠（BDH Chemicals Ltd，Poole，England）24小时。将两种诱导剂溶解在水中并过滤灭菌，然后加入培养基中。收集培养基和根并储存在-80℃。对于根组织，将50mg干燥组织在3ml乙酸乙酯（EtOAc）中混合并涡旋20秒。 将溶液通过Whatman No.1滤纸过滤，并在氮气流下在40℃下干燥。称量干燥的样品并溶解在30mu;lEtOAc中。对于培养基，将50ml样品解冻并与30ml EtOAc混合，然后涡旋30秒。如上所述通过氮气流回收并干燥有机相。将干燥的样品称重并溶解在50mu;lEtOAc中。等份的EtOAc提取物和反式白藜芦醇1（Sigma-Aldrich，Budapest，Hungary）是点样到20·20（TLC）硅胶0001/05553 /（Merck）上。使用EtOAc：AcOH：H 2 O（17：1：2）的流动相（Nepote等人，2004）进行样品的分离。将板空气干燥并在254nm的UV光下观察。通过扫描图像并使用ImageJ（Scion Corporation，Frederick，Maryland，USA）测量斑点的强度来确定254nm处样品的相对量。
3 结果
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