浮萍物种多样性对养猪场废水中生物生产力的影响和脱氮除磷效率的研究
原文作者 Zhao Zhaoa, Huijuan Shia, Yang Liub, Hai Zhaob, Haifeng Sua, Maolin Wanga， Yun Zhaoa
单位 a：中国生物资源与生态环境教育部的重点实验室，四川大学，生命科学学院，成都610064
b：中国科学院成都生物研究所，中国科学院，成都610041
摘要：本篇文章主要研究温度、光强、氮和磷的浓度对生物量的影响以及对单一浮萍和混合浮萍的淀粉含量（点浮萍OT, 青萍OT）进行评估。在低光强条件下，混合浮萍比单一浮萍累积更多的淀粉。在猪场废水中，混合浮萍比那些单一浮萍更能提高生物量和脱氮除磷效率。此外，我们还对点浮萍C3,青萍C2, 紫萍C1以及他们的混合浮萍对恢复营养物质和生物量进行了分析。结果表明，青萍C2有最高的氮磷含量，同时点浮萍 C3具有最高的淀粉含量和L的点状混合物， 点浮萍C3和青萍C2的混合浮萍具有最大的营养物质去除率和最高的生物量。与点浮萍C3和青萍C2单种浮萍相比，它们在混合浮萍中生物量分别增加了17.0％和39.8％。
关键词：浮萍；混合物；猪场废水；生物量；淀粉
1.绪论
每年从养猪场排出大量营养物质，大大增加了当地的河流和湖泊水体的富营养化水平。对于养猪业，越来越重要的是开发一个简单、便宜又节能的方法去净化水。很多相关的技术已经被开发（Chen等，2004；Kim等人，2004；Bortone，2009年），废水中的营养物质转化为有价值的植物生物量，此外充分利用收割后的生物量用来回收营养物质的方式，已经引起了越来越多的注意（徐，陈，2011年）。例如，在废水中栽培湿地植物（能够利用过剩的营养物质）已被发现是一个较好的净化水资源的方法。这些植物不仅能以简单、廉价的和高效的方式来净化水，而且由植物产生的生物量也可以用作饲料牛（Fang等人，2007年）。属于浮萍科的浮萍生活在世界各地的缓缓流淌的水域，除了北极和南极地区。它们有37种，分别属于4个属（浮萍属，紫萍属，微萍属和无根萍属）（Cheng和Stomp，2009年）。浮萍主要是无性繁殖，生长快，并且能迅速提高生物量。许多种浮萍能够以每2或3天的速度加倍积累生物量（Rusoff等人，1980）。一旦建立这样的系统，浮萍能有效降低了空气中二氧化碳的含量以及水中的氮、磷含量(Stomp ，2005)。由于猪废水已经含有丰富的氮、磷，它们给浮萍提供了一个现成的，具有成本效益的生长培养基。浮萍可以从废水中吸收营养，从而进行废水净化和生物量生产的整合（Su等人，2012）。此外，浮萍还有已知的容忍高氨氮和摄取氮素的能力，尤其具有摄取在养猪场废水中的主导氮素形态--氨的能力（Chen等，2002年）。由于这些特点，不同的品种浮萍在许多国家已经用于处理市政、工业、和猪废水，包括孟加拉国、以色列和美国(Oron, 1994； Vander Steen 等, 1998；El-Shafai等, 2007)。
此外，浮萍由于其优异的生长和淀粉积累能力被认为是用于生物乙醇生产的潜在生物能源(Cheng and Stomp, 2009； Xu等, 2011; Chen等, 2012)。它也可以生产高水平的蛋白质和淀粉。在不同的条件下生长的各种浮萍的蛋白质含量占干重的15％至45％（Porath等人，1979），淀粉含量的范围是3％至75％（Reid，Bieleski，1970）。
此前，通过营养恢复产生有价值的生物量被发现在不同物种和地理株的浮萍之间存在巨大差异（Bergmann等人，2000）。因此，从当地各种浮萍中选择最佳的浮萍品系是建立浮萍种植制度的一个有效的先决条件(Xu ， Shen ，2011)。此外，只有单一品种，如点浮萍、青萍和无根萍被报道，在一时间成为生活污水处理和生物燃料生产的高潜力的候选物种（程等，2002；Suppadit，2011；葛等，2012）。然而，在整个工业系统中难以保持单一品种，因为其他物种的侵入会污染系统（Su等，2012）。然而，很少有人注意到不同的浮萍种类的混合物在废水处理中的作用以及生产的生物量。虽然混合培养先前被发现与单一培养相比增加了整体蛋氨酸含量（伊斯梅尔，1998），但是没有对生物量和淀粉含量进行研究。一些研究人员还推测，某些有利的微藻混合培养可能会增加生物量生产，因为自己的优势可以优化系统性能（OLGUIN，2003年），但是这并没有得到适当的调查。因此，评估浮萍的混合培养物相较于单一物种是否可以增强养猪场废水的营养恢复和生物量生产仍然是必要的。在本篇文章中，我们对2种本地浮萍（青萍和点浮萍）无论是在混合物或单一栽培，在不同光强度，温度和营养物浓度条件下对提高其生物质和淀粉含量的能力进行了研究。并且对5种不同来源的本地浮萍（青萍、紫萍和点浮萍）在营养恢复和生物量生产的效率方面进行混合物和单一物种的进一步评估。
2.方法
2.1．材料和培养物条件
品系点浮萍OT和青萍OT分别从中国的回龙，成都同池隔离获得。此外，紫萍C1，青萍和点浮萍C3分别在四川省成都市污水处理设施获得。在收集之后，将植物用蒸馏水轻轻漂洗，清除杂物，将健康的叶状体放置在塑料容器的霍格兰E 的溶液中（（宏量营养素：1毫升的KH 2 PO4，10毫升的KNO3，2毫升的Ca（NO 3）2，和2毫升硫酸镁；微量营养素：46毫升H3BO3，9毫升的MnCl2·4H2O，0.76 毫升的ZnSO4·7H2O, 0.32毫升的CuSO4, and 0.55毫升的H2MoO4；铁源： 78毫升的Fe-EDTA。）在适应了霍格兰E 溶液七天之后，将植物转移到5％猪废水液体实验条件下用以产生新生和年轻的快速生长复叶。猪废水来源于四川省乐山市的猪农场。在未稀释的猪废水中NH4-N和PO4-P的浓度分别为1020毫克/ L和224毫克/升。
2.2．实验方案
浮萍在1000ml塑料容器（12厘米 times;18厘米 times;5厘米）中用一个7000勒克司的光强度的16:8的光暗周期培养12天，温度为25 plusmn; 1摄氏度。营养液浓度为霍格兰E 溶液浓度的十分之一。混合浮萍培养物由浮萍的两种或三种以比值1:1或1:1:1结合获得。最初总共以3克的新鲜材料接种，单层复叶覆盖整个水面。
我们对在霍格兰E 溶液条件下的点浮萍OT、青萍OT及其混合物受温度，光照强度，氮磷浓度的影响产生的生物量和淀粉含量进行了分析。温度设定在20，25，或30℃，光强度分别设为2000，5000，或10,000勒克斯，而营养条件根据约瑟芬的方法调节（约瑟芬等人，2011），其中该溶液全强度浓度（340毫克N L-1，150毫克P L-1）被选为高养分有效性处理，然后稀释。因此，N和P中的最终浓度如下：（340毫克N L-1 150毫克P L-1），（34毫克N L-1 15毫克P L-1），（3.4毫克N L-1 1.5毫克P L-1），（0.34毫克N L-1 0.15毫克P L-1）和（0毫克N L - 1 0毫克P L-1）。为了减少藻类生长，并保持营养水平恒定，我们每两天更新生长溶液。每个处理重复三次。
对于猪废水研究，点浮萍、青萍OT及其混合物培养在含51毫克/升的NH 4-N和12毫克/升PO4-P的养猪废水中，用于营养恢复和生物量产生。此外紫萍C1，青萍C2和点浮萍C3和它们的不同组合在类似的条件下进行了研究，但略微修改了氨氮的浓度（31.6毫克/升）和（PO 4-P2.4毫克/升）。为了保持最佳的生长环境，在整个实验过程中，pH调节至约7.0。整个实验过程中每天用自来水更换蒸发掉的水。
为了测量鲜重（FW），浮萍在洗衣机中进行离心以除去多余的水，随后用平衡仪测量（贝格曼等人，2000）。为了测量干重（DW），将样品在60℃下干燥直到重量恒定。增长率计算方式如下：增长率=增加干重/区域/次（克/平方米/天）。
此外，微凯氏N-二消化用于测定的生物量样品的总氮含量（马库斯等，1985），而P含量由Vanado-molybdo磷酸比色法（郭，1996年）测定，蛋白含量通过Ntimes;6.25来进行粗测定（Xiao等，2013年）。
为了测量淀粉含量，干燥浮萍粉末在3mL的6M盐酸搅匀，在水浴2小时沸水加热，用HCl（6M）或KOH（6M）调节pH至7.0plusmn;0.5，然后加入200mu;L铅（COOH）2，最后以5000g的速率离心5分钟。在上清液中的糖通过HPLC（热电2795，热电公司，美国）和蒸发光散射检测器进行分析（Alltech公司ELSD2000，所有的高科技，公司，美国），淀粉含量使用总糖测定内容法（淀粉含量=葡萄糖含量times;0.909）（Zhang等2011）进行测定。
最后，在猪废水中的NH 4-N和PO4-P水平通过使用的PhotoLab6100（WTW公司，德国）的Spectroquant测试试剂盒（Merck公司，德国）测量。
2.3. 计算和统计
每个数据点代表每个实验三个样品的结果。所有结果用t检验进行了评估，在图中以plusmn;标准误差和显著（P lt;0.5）表示。
3. 结果与讨论
3.1. 温度对浮萍生长的影响
温度的变化对在不同温度下表现出不同生长特点的两种菌株的增长速度和浮萍淀粉含量有着重大影响。结果表明，点浮萍OT和青萍OT的增长率的最适温度为25℃（4.2克/平方米/天）和20℃（3.9克/平方米/天），分别为（图1a）。有趣的是，点浮萍OT和青萍OT的混合物的增长率是在高温下的（30℃和25℃）之间，但它与点状萍OT在20℃的增长率几乎相同。可选择地，点浮萍OT，青萍OT以及其混合物的淀粉含量分别为28.6％，34.9％和39.7％，并且随着温度从20增加到30℃而逐渐降低（图1a）。但总体而言，混合培养在生物量生产和淀粉含量方面并没有比单养有显著的优势。
3.2. 光照强度对浮萍生长的影响
光强度显著影响浮萍的增长速度。在弱光下（2000勒克司）点浮萍OT、青萍OT和其混合物的增长速度分别是1.31，0.71和1.28克/平方米/天。当光强度提高到5000勒克斯时，增速分别增加1.3，2.5和1.1倍，但没有在10,000勒克斯时（图2a）进一步增加。
在5000和10000勒克斯的光强度时，该混合物的生长速率在青萍OT和点浮萍OT单一物种的生长速率之间。有趣的是，当混合物达到最高的增长率（1.28克/平方米/天）时，几乎和点浮萍OT在低光照（2000勒克斯）（Pgt; 0.05）时的生长速率（1.31克/平方米/天）相同。据观察，在低光强下，这两个点浮萍OT和青萍OT的混合的根均比较单一的点浮萍OT和青萍OT的根长（未发表的数据）。在这点上，有关于浮萍科物种的根参与于养分摄取（Cedergreen和Madsen的，2002年）的长期争议，但最近的研究已经表明，点浮萍可由根和叶两者摄取氮（Fang等人，2007年）。此外，青萍可以取决于光强度调节，通过复叶或根吸收NO3-（Cedergreen和马德森2004年）。上述结果表明，在低光时，点浮萍OT和青萍OT之间的竞争促进长根，增加NO3-的吸收，促进生长。
浮萍的淀粉含量趋于在越高光强度时（图2b）越高。当光强从2000勒克斯增加至5000勒克斯时，单一物种的点浮萍OT和青萍OT的淀粉含量分别提高1.6和2.2倍。但随着光照强度5000勒克斯增加至10,000勒克斯，青萍OT的淀粉含量没有明显增加，但是，点浮萍OT的淀粉含量增加了1.53倍。当点浮萍OT和青萍OT混合培养，当光强度为2000勒克斯增加到5000勒克司，淀粉含量增加1.5倍，但在10,000勒克斯淀粉含量下降3％。
在10,000勒克斯照度时，该混合物（21.8％DW）的淀粉含量在点浮萍OT（24.6％DW）和青萍OT（17.6％DW）之间，但在5000和2000勒克斯照度时，混合物（22.3％和8.8％）的淀粉含量比单一点浮萍OT（18.3％和7.0％）和青萍OT（17.0％和5.4％）显著更高（图2b）。
有较高淀粉含量的浮萍更有利于在低辐照物种中的竞争，所以混合培养的浮萍与单作的相比，更能积累更多的淀粉。在四川盆地经常气候变化。阴雨天在成都经常发生，导致常年低光强，并且备有记录最低值，在中午约1000勒克司（肖等人，2013年）。因此，在低光照区域，如四川盆地，积累淀粉的理想方法是通过浮萍的混合培养。
3.3. 氮，磷含量对浮萍生长的影响
据观察，浮萍生长在高氮、磷浓度的地方时，叶状体大，细而呈深绿色和根短，薄。相比之下，植物生长在低氮、磷浓度的地方时。叶状体很小，厚且颜色苍白，根又长又壮。
结果显示，点浮萍OT 、青萍OT及其混合物的增长速度的显著改变，取决于氮，磷浓度（图3a）。在A和B中较高的氮，磷浓度的地方，为点浮萍OT单独生长有利。此外，点浮萍OT的生长速率在低于溶液B水平时（34.5毫克N L-1和15mg P L-1）显著下降。另外，青萍 OT的增长速度并没有明显的变化，直到它们在D和E中，此时的生长速率开始以极快的速度下降。有趣
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