抗hECSM2小鼠单克隆抗体的制备及其在hECSM2表达分析中的应用外文翻译资料

 2022-08-04 14:07:43

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抗hECSM2小鼠单克隆抗体的制备及其在hECSM2表达分析中的应用

陈良音，*马聪，*何静，何怡，王江曼，苟兰图，杨金良

人内皮细胞特异性分子2（hECSM2）是一种新近鉴定的基因，其生物学功能尚不清楚。这项研究的目的是制备抗hECSM2小鼠单克隆抗体，并研究hECSM2在细胞系和人体组织中的内源表达。用杂交瘤方法制备了特异性针对hECSM2的小鼠单克隆抗体。使用蛋白质印迹和流式细胞仪检测抗体的特异性。免疫荧光和免疫组织化学分别用于研究hECSM2在不同类型的细胞系和人体组织中的内源性表达。选择了两个分泌抗hECSM2 MAb的杂交瘤。实验表明这两种抗体对hECSM2具有高度特异性，内源性hECSM2位于内皮细胞膜上。我们的抗hECSM2小鼠抗体可以用于蛋白质印迹，流式细胞仪和免疫组化研究，并且可以作为研究hECSM2的功能和分布的有价值的工具。

简介

人内皮细胞特异性分子2（hECSM2）是一种新型的内皮基因，由Lukasz Huminiecki于2000年通过计算机克隆技术发现，该hECSM2基因被定位在人染色体5的5q31位，跨度为10.3kb。 推测其可编码205个氨基酸，所组成蛋白质的分子量为21kDa。 hECSM2的蛋白质主要位于细胞膜上。 生物信息学分析和GFP，myc或FLAG标签的ECSM2蛋白在几种哺乳动物细胞系统中的异源表达进一步表明，ECSM2是一种由N端胞外域（ECD），单个跨膜域（TM）组成的细胞膜蛋白。 ，以及一个小的高度保守的C末端胞内域（ICD）。 同源蛋白分析表明，hECSM2的跨膜结构域和C末端结构域在许多物种中高度保守。

目前，关于ECSM2功能的研究很少。以前的研究表明，ECSM2基因通过定量RT-PCR和原位杂交技术主要在血管内皮细胞（EC）中大量表达。 SiRNA被用于抑制ECSM2表达，从而导致趋化性降低和管形成受损，提示ECSM2在血管生成中的作用。进行了Ayeast 2杂交筛选，并确定了filaminA是ECSM2细胞内结构域的结合伴侣。重建的哺乳动物细胞系统表明，ECSM2可以与表皮生长因子受体（EGFR）发生相互作用，从而减弱EGF诱导的细胞迁移，可能是通过抑制Shc-Ras-ERK（MAP激酶）途径。细胞聚集和transwell分析表明，ECSM2促进了细胞间粘附，并减弱了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）驱动的EC迁移。通过ECSM2在EC中的过表达或敲低获得或丧失功能的实验表明，ECSM2通过FGF受体（FGFR）-细胞外调节激酶（ERK）-局灶性粘附激酶（FAK）途径调节bFGF定向的EC运动性。

曾一度仅被认为是位于血管内壁上的单层细胞，但内皮细胞近来已成为一种器官，其功能与人体中的任何器官一样复杂。 它不仅是正常的有机体发育，排卵，胚胎形成和伤口愈合的基础，而且还至关重要地参与了包括动脉粥样硬化和癌症在内的许多疾病的病原体实质性研究。因此，在鉴定新基因方面引起了极大的兴趣 在血管内皮细胞中特异性表达并研究其生物学功能，这将有助于提供新的治疗靶点。

到目前为止，市场上还没有高质量的商用抗hECSM2单克隆抗体。 Shi和Ma产生的兔抗ECSM2单克隆抗体（RabMAb）使用GST融合蛋白，其中包含人ECSM2的整个保守C末端胞内域（ICD）作为免疫原。 （2）在本研究中，我们使用CHO-ECSM2细胞（用hECSM2基因转染了CHO细胞）产生了人类抗hECSM2单克隆抗体（MAb），该细胞在细胞表面表达人ECSM2的N末端胞外域（ECD）为 免疫原。 通过杂交瘤方法，我们成功地选择了两种分泌对hECSM2高度特异性的抗hECSM2杂交瘤，这些抗体可用于Western blot，流式细胞术和免疫组织化学。这可能为进一步研究ECSM2的生物学功能提供了极好的工具。

材料和方法

hECSM2的生物信息学

ECSM2的氨基酸序列是从Swiss-Prot/TrEMBL数据库中的ExPASy系统（www.expasy.org）中检索到的。hECSM2的跨膜结构域由SOSUI（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui）预测。

细胞培养

完整的hECSM2基因被克隆到pcDNA3.1载体上，并在此之前通过真核表达技术转化为中国仓鼠卵巢癌细胞（CHO）。 该细胞系被命名为CHO-ECSM2，并在我们的实验室中保存过。 鼠骨髓瘤细胞系SP2 / 0在含有10％胎牛血清（FBS，Hyclone，Beijing，China）和1mL 100x青霉素/链霉素（PAA Laboratories，Pasching，Austria）的RPMI1640培养基中生长。 在DMEM培养基中维持人脐静脉内皮细胞系（HUVEC），CHO，人结肠癌细胞系HT29，人乳腺癌细胞系MCF-7，人卵巢癌细胞SK-OV-3和人肾上皮细胞系293T 补充10％FBS（Hyclone）和1mL 100x青霉素/链霉素（PAA实验室）。 Hy-bridoma细胞按照制造商的说明，在添加有HAT（Sigma，St.Louis，MO）的20％FBS的RPMI 1640培养基中生长。

杂交瘤制备

如houml;hler和Milstein所述，通过杂交瘤方法产生了针对hECSM2的单克隆抗体。 简而言之，对8-12周的BALB / c小鼠腹膜内用CHO-ECSM2细胞进行免疫（每次注射5bull;106个细胞）三次。 通过小鼠尾静脉收集血液，然后测试血清滴度。 选择具有最高抗体滴度的小鼠进行细胞融合。

杂交瘤的筛选

使用HUVEC（作为阳性对照），CHO-ECMS2细胞（实验组）筛选阳性杂交瘤，

如图。 1. hECSM2的表征。 （A）hECSM2的氨基酸序列。 （B）hECSM2的示意图结构。

抗HECSM2的单克隆抗体

用细胞结合酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定被低聚甲醛固定的CHO（作为阴性对照）。将细胞接种在96孔培养板中（105个细胞/孔）过夜，然后将板用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.0）洗涤3次，并在室温下用4％甲缩醛将细胞固定20分钟。 。用含0.05％Tween-20的PBS洗涤3次后，将200mu;L含5％脱脂乳的PBS加入每个孔中，并将板在37℃下孵育2h。向每个孔中加入杂交瘤细胞上清液（100mL），使其在37℃下反应1h。洗涤3次后，向每个孔中添加50mu;LPBS中以1：10,000稀释的过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG抗体，并将其孵育在37℃下放置1小时。洗涤3次后，向每个孔中加入100mu;L酶底物，并在5-20分钟后用HCL终止酶反应。用微板读取器测量450nm处的吸光度。作为阴性杂交瘤的临界值，采用阴性对照引起的2bull;OD值。杂交瘤的阳性克隆根据有限稀释法亚克隆至少两次，得到单克隆细胞。

蛋白质印迹分析

收集HUVEC，CHO-ECSM2和CHO细胞系，然后用细胞裂解缓冲液RIPA（Beyotime，中国上海）和超声处理； 通过SDS-PAGE分离上清液，然后电泳转移至PVDF膜上。 将膜在TBST缓冲液（20mM Tris，150mMNaCl和0.1％Tween-20 [pH 7.5]）中用5％脱脂牛奶封闭，在4℃过夜。 封闭后，将膜与我们制备的阳性杂交瘤上清液一起孵育。 将过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG抗体用作第二抗体。 该印迹是用ECLWestern印迹检测试剂（Millipore，中国上海）开发的。

流式细胞仪分析

通过将HUVEC，CHO-ECSM2和CHO细胞系（1bull;106）与阳性杂交瘤上清液一起进行细胞表面分子的两步标记，然后用TIFC标记的山羊抗小鼠检测ECSM2特异性MAbs的结合 三次洗涤后的免疫球蛋白。 Ig结合和细胞洗涤步骤在4℃下进行。 通过FACS分析（Becton Dickerson，Franklin Lakes，NJ）测定细胞表面荧光。

免疫荧光

HUVEC，CHO-ECSM2和CHO在6孔培养板中生长过夜。 第二天将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，然后用10％正常山羊血清封闭，然后与阳性杂交瘤上清液一起孵育。 用PBS缓冲液洗涤3次后，将细胞与FITC标记的山羊抗小鼠抗体一起孵育。 洗涤细胞并在荧光显微镜（Leica，Wetzlar，德国）下观察。

如图 2.免疫血清对hECSM2具有高度特异性。 （a）将CHO细胞分成相等的部分，然后分别与免疫血清（绿线）和等效的PBS（峰值）温育。 随后通过TIFC标记的山羊抗小鼠IgG抗体测量与hECSM2的结合。 没有观察到荧光位移。 （b）未免疫的血清与CHO-ECSM2细胞反应（如a）。 没有观察到荧光位移。 （c）免疫血清对CHO-ECSM2细胞有反应（如a和b所示）。 观察到荧光位移。

免疫组织学

人脐带组织和胎盘组织的石蜡切片由华西医学院（成都）的王自强教授和沉杨梅教授提供。大肠癌组织来自四川大学华西医院。所有患者均在知情同意下同意参加研究。该研究得到四川大学制度伦理委员会的批准。首先将这些组织固定在4％甲醛中，在乙醇系列中脱水，用二甲苯处理，并固定在石蜡中。将两个组织的4mm厚的部分切下并安装在载玻片上。对于免疫组织学，在柠檬酸盐缓冲液中脱亲和化和抗原决定簇修复后，通过将切片在10％正常山羊血清PBS（pH7.0）中室温孵育2次来封闭非特异性结合位点，并与阳性杂交瘤上清液一起孵育将其作为一抗在4℃过夜，然后在TBS中洗涤，并与在封闭缓冲液中稀释的生物素化山羊抗小鼠IgG孵育，然后加入抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物40分钟。最后，将玻片在DAB溶液（武汉，中国，武汉）中孵育2–5分钟。用山羊抗人CD31抗体进行阳性对照。在显微镜下观察玻片并拍照。

抗体亲和力

通过细胞结合ELISA确定单克隆抗体的阳性亲和力。将三组系列稀释的HUVEC细胞接种在96孔培养板上。每个板的细胞密度降低了一半。将细胞培养3天，然后将板用PBS（pH 7.0）洗涤3次，并在室温下将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟。用含0.05％Tween-20的PBS（PBST）洗涤3次后，向每个孔中加入200mL含5％脱脂乳的PBS，并将板孵育37℃。用无血清杂交瘤细胞上清液PBST洗涤3次后，用SDS-PAGE测定的确切抗体浓度，连续稀释并添加到每个孔中。使反应在37°C下进行。洗涤后，将50mL过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG抗体以1：5000的比例稀释。将PBS加到每个孔中，并将板在37℃下温育40分钟。洗涤3次后，向每个孔中加入100mL酶底物，并在5-20分钟后用HCL终止酶反应。用酶标仪测量450nm处的吸光度。数据分析和OD的S形曲线相对于总抗体浓度的对数通过Microsoft Office Excel（华盛顿州雷德蒙德）进行。为此方程计算亲和常数（K aff）：K aff = 1/2（2 [Abrsquo;] t – [Ab] t）。 [Ab] t和[Ab] t是分别用[Ag]和[Ag]镀的OD-50和OD-50处各孔中可测量的总抗体浓度。[Ag]和[Ag]不正确抗原浓度，但是是板上抗原密度的量度。

如图 3.抗体可用于蛋白质印迹和FACS。 （A）MAb对在真核细胞细胞中表达的hECSM2的反应性。 CHO，CHO-ECSM2和HUVEC的裂解液通过SDS-PAGE分离，然后电泳转移到PVDF膜上。将该膜分别与6C24和B11杂交瘤上清液一起孵育。将过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗进行孵育。用ECL Western印迹检测试剂检测印迹。分子量标记（kD）指示在左侧。 （B）对ECSM2高度特异的B11杂交瘤上清液。（a）将CHO细胞分成相等的部分，然后分别与B11杂交瘤上清液（红线）和等效的PBS（峰值）孵育。通过TIFC标记的山羊抗小鼠IgG抗体测量与hECSM2的结合。没有观察到荧光偏移。 （b）CHO-ECSM2细胞与相同的上清液反应（如a）。观察到荧光位移。 （c）HUVEC细胞与相同的上清液反应（如a和b）。观察到荧光位移。未显示6C24抗体。

如图 4.检测ECSM2在不同细胞系中的表达。 通过SDS-PAGE分离CHO-ECSM2，HUVEC和非内皮细胞系（包括CHO，HT29，MCF-7，SK-OV-3和293T）的裂解物，并电泳转移至PVDF膜上。 将膜与B11杂交瘤上清液一起温育，然后与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG抗体作为第二抗体温育。 用ECLWestern印迹检测试剂检测印迹。 分子量标记（kD）指示在左侧。 未显示6C24抗体。

结果

hECSM2的表征

hECSM2（SwissProt：Q19T08）的整个氨基序列如图1A所示。该hECSM2跨膜蛋白由一个包含100个氨基酸的N端胞外结构域，一个包含119个至147个氨基酸残基的跨膜结构域和一个包含29个氨基酸的58个氨基酸组成的高度保守的小跨膜结构域。 hECSM2具有包含20个氨基酸的信号肽（图1B）。

产生hECSM2特异性小鼠单抗

我们使用在细胞表面表达人ECSM2 N末端胞外域的CHO-ECSM2细胞作为免疫原，并按照材料和方法部分中的描述免疫了四只BALB / c小鼠。 使用CHO-ECSM2细胞系通过细胞ELISA测试血清滴度。 通过FACS分析，使具有最高滴度的小鼠血清结合至CHO-ECSM2细胞系的表面，如荧光强度变化所示（图2）。 这些结果表明我们成功地免疫了小鼠。

用B淋巴瘤杂交瘤技术，将免疫的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞（SP2 / 0）融合，并通过连续筛选，获得了两个可分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤，命名为6C24和B11。

6C24

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