通过固定在低分子量壳聚糖纳米颗粒上提高藻酸盐裂解酶的热稳定性和抗生物膜活性外文翻译资料

 2022-08-06 09:39:24

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通过固定在低分子量壳聚糖纳米颗粒上提高藻酸盐裂解酶的热稳定性和抗生物膜活性

李尚勇1,2，王亚男1，小李1，李淑淑2，郑秀文2和李明硕2,*

  1. 青岛大学基础医学院药理学教研室，青岛266071；lisy@qdu.edu.cn (S.L.); sunshine4581@163.com (Y.W.); lilix0823@163.com (X.L.)
  2. 生物系统学系细胞异质性研究中心分子癌症生物学实验室

淑明女子大学，韩国龙山区孝昌苑gil-52，首尔140-742;min9996@nate.com (B.S.L.); samiljung@sookmyung.ac.kr (S.J.)

* 对应：mslee@sookmyung.ac.kr

检查

收到：2019年8月15日;接受：2019年9月11日;发布时间：2019年9月14日 更新

摘要：细菌生物膜引起严重的抗生素耐药性。细胞外聚合物（EPS）是细菌生物膜中的主要成分。藻酸盐是铜绿假单胞菌生物膜中的关键EPS成分，负责表面粘附和生物膜的稳定化。海藻酸盐裂解酶已成为一种有效的治疗策略，旨在降解铜绿假单胞菌生物膜中的海藻酸盐。但是，该酶的应用受到其稳定性差的限制。在这项研究中，使用低分子量壳聚糖合成了壳聚糖纳米颗粒（CS-NPs），藻酸盐裂解酶Aly08固定在低分子量壳聚糖纳米颗粒（AL-LMW-CS-NPs）上。结果，固定化显着增强了Aly08 的热稳定性和可重复使用性。此外，与游离的Aly08相比，固定化的AL-LMW-CS-NPs在抑制生物膜形成和破坏已建立的铜绿假单胞菌成熟生物膜方面表现出更高的效率，这可能会降低其共聚焦显微镜下的生物量和厚度。此外，生物膜破坏极大地增加了铜绿假单胞菌的抗生素敏感性。这项研究将有助于藻酸盐裂解酶作为抗生物膜剂的进一步发展。

关键字：固定化；壳聚糖纳米颗粒；海藻酸裂解酶抗生物膜活性；抗生素敏感性

介绍

细菌生物膜通常被定义为结构化，专门化和粘附的微生物群落。与浮游生物相比，生物膜的存在将细菌对常规抗生素的敏感性降低了约1000倍[1–3]。微生物细胞产生的复杂的细胞外聚合物（EPS） 被认为在细菌生物膜的粘附和聚集，介导细胞与细胞以及细胞与表面的连接以及保护细菌从宿主的免疫系统逃逸中起着重要的作用[4,5]。最近的估计表明，生物膜占微生物感染的80％以上，但是，传统的抗菌剂比游离于生物膜的微生物对游离细菌更有效，这是由于其在生物膜中的渗透力受损。此外， 细菌对抗生素的耐药性问题已引起越来越多的关注[6,7]。因此，开发同时破坏生物膜结构稳定性和确保安全性的新策略至关重要。

迄今为止，已经引入了许多策略来杀死生物膜中的致病细菌，例如应用弱有机酸（WOA），噬菌体，抗菌肽（AMPs），铁螯合，通过干扰所涉及的信号传导以及光照和光照射途径来改变生物膜的发育， [8–11]。

噬菌体在铜绿假单胞菌治疗中的应用感染作为抗生素的替代品已经引起了人们的注意，已经针对137个针对假单胞菌属的噬菌体进行了表征，但是它面临着细菌耐药性和稳定性差的问题[12,13]。大量AMP，包括crocropin P1，magainin II， LL37等，靶向细菌细胞质膜，导致细胞死亡[14,15]。相反，AMP的缺点是溶血性强，蛋白水解敏感和高成本[16]。另外，WOA的临床应用中存在的问题包括如何有效地针对目标物种选择酸和未知的抗菌机制。光辐射和铁螯合的治疗还具有明显的细胞毒性潜在问题。在不同的方法中，与单独使用抗生素相比，已证明使用可生物降解的酶通过破坏EPS与抗生素的结合来去除生物膜可提高细菌对抗菌剂的敏感性[17–19]。

铜绿假单胞菌是一种机会性人类病原体，是免疫功能低下的个体和患有囊性纤维化（CF）的个体 致死和发病的主要病因。铜绿假单胞菌侵入肺上皮并显示出从非藻酸盐产生（非粘液）到藻酸盐产生 菌株（粘液）的遗传转化，这支持了肺粘膜中更高的细菌粘附性，生物膜的稳定和免疫逃逸[20,21]。 海藻酸盐是一种酸性杂多糖，由beta;-d-甘露糖醛酸酯（M）和alpha;-1-古洛糖酸酯（G）组成，这是铜绿假单胞菌生物膜中的关键EPS成分[22]。因此，通过使用藻酸盐裂解酶靶向破坏生物膜中的藻酸盐已经成为一种有效的治疗策略。尽管已经克隆和表征了各种藻酸盐裂解酶，但是对其抗生物膜活性的研究却很少，并且该酶应用的主要限制是其不稳定性强。为了有效地提高藻酸盐裂解酶的稳定性和可重复使用性，酶固定化策略的实施引起了越来越多的关注。壳聚糖有可广泛获得、低成本、更好的生物降解性、生物相容性、更好的负载大量酶、无毒性等优点。因此，与天然生物分子相比，壳聚糖已被确立为合适的酶固定基质[23,24]。此外，天然生物聚合物壳聚糖已显示具有广谱抗菌活性，而不会增加耐药性[23]。最近，固定有环丙沙星的藻酸盐裂解酶固定化壳聚糖纳米颗粒（CS-NPs）对CF中与生物膜相关的粘液状铜绿假单胞菌感染的抗微生物活性有了很大的提高[21]。

在我们先前的研究中，海藻弧菌sp.SY01克隆了一种藻酸盐裂解酶Aly08，它可以有效地发挥藻酸盐降解作用。从海洋细菌弧菌属细菌中克隆了一种藻酸盐裂解酶Aly08。SY01可有效发挥藻酸盐降解作用[25]。为了提高其生物学性能，检测到固定在低分子量（LMW）CS-NP上的藻酸盐裂解酶Aly08。与游离酶相比，固定化酶的生物学特性显著增强，例如热稳定性和可重复使用性。这项研究还表明，固定化酶在抑制铜绿假单胞菌生物膜形成和破坏成熟的生物膜方面比游离酶更有效。此外，生物膜的破坏极大地增加了铜绿假单胞菌的抗生素敏感性。因此，CS-NPs将有助于藻酸盐裂解酶作为抗生物膜剂的进一步发展。

结果和讨论

    1. 壳聚糖纳米粒子的合成与测定

作为地球上最丰富的天然聚合物之一，壳聚糖及其合成的纳米颗粒已广泛用于生物医学。CS-NP 的理化性质因壳聚糖的来源和加工方法而异。高分子量壳聚糖（HMW-CS）在中性条件下几乎不溶解。 高分子量壳聚糖纳米粒子（HMW-CS-NPs）的制备过程需要大量的HCl处理，这大大限制了其实际应用。同时，壳聚糖的分子量显着影响CS-NP的尺寸和尺寸分散。与HMW-CS相比，低分子量壳聚糖（LMW-CS） 在CS-NPs的生产中显示出许多优势，例如更好的水溶性，更小的尺寸和更高的载药量。到目前为止， LMW-CS是由几家公司生产的。

方法：物理降解法（微波和超声波），化学降解法（酸和碱处理）和酶法[26,27]。与物理和化学方法相比，酶法生产方法在中等反应条件，较低的环境污染风险和易于控制的产品上具有优势[28]。就产生LMW-CS的酶法而言，溶菌酶和壳聚糖酶是两种主要广泛使用的酶。[29,30]。溶菌酶非特异性和无效地水解壳聚糖。与溶菌酶相比，壳聚糖酶能更高效地水解壳聚糖，但是，其切割片段通常太小，无法轻易控制反应条件[31]。在此，我们使用在我们实验室中纯化的壳聚糖酶CsnM开发了一种快速有效的LMW-CS生产方案[32]。在我们以前的研究中，CsnM显示了冷适应特性，反应易于控制。当反应温度高于40◦C时，酶立即失去活性。根据粘度分析，本研究中使用的LMW-CS的平均分子量为8.76 kDa，适用于合成低分子量壳聚糖纳米颗粒（LMW-CS-NPs）。

进行透射电子显微镜（TEM）检查合成的LMW-CS-NP的形态和大小（图1).TEM图像显示，CS-NP具有几乎球形的形状和光滑的表面，并且纳米颗粒的尺寸为100至300nm。作为对照，由HMW-CS在相同反应条件下制备的CS-NP的直径通常大于500 nm（图S1）。

图1.纳米粒子在500 nm（A）和100 nm（B）的透射电子显微镜（TEM）显微照片。将样品固定在铜网上并在室温下干燥。然后将它们用磷酸钨酸染色并通过TEM检查。

在这项研究中，藻酸盐裂解酶Aly08用于合成固定有藻酸盐裂解酶的低分子量壳聚糖纳米颗粒

（AL-LMW-CS-NPs）。Aly08是一种典型的内切型藻酸盐裂解酶，在我们的实验室中已得到充分表征[25]。除了上述的水溶性和小尺寸优点外，LMW-CS-NP以相同的质量显示出越来越多的链，从而导致表面上有更多的游离氨基固定化蛋白质。根据茚三酮分析，HMW-CS-NPs表面的游离氨基酸数量仅为LMW- CS-NPs的27.6％。

Aly08的负载量（LC）直接受其浓度影响（图2A)的LC

当Aly08浓度在0.05–0.30 mg/mL范围内时，Aly08明显从192.3增加到787.3 mg/g。浓度超过0.3 mg/mL后，Aly08的LC仅缓慢增加。如图所示2B，当Aly08的浓度从0.05增加到0.40 mg/mL时，加载效率（％LE）从79.3％降低到37.5％。这些发现表明，本研究中使用的AL-LMW-CS-NPs几乎饱和至0.30 mg / mL。如图所示2C，在Aly08加载（0.3mg / mL）之后，在AL-LMW-CS-NPs的表面上测定了40.2％的游离氨基，表明LMW-CS-NPs的约59.8％的氨基与Aly08缀合。为了确定合成的AL-LMW-CS-NP 的酶促活性，将具有相同蛋白质浓度的游离Aly08用作对照。如图所示2D，固定化的AL-LMW-CS-NP显示出有效的活性（68.7％）。游离的Aly08与水溶性LMW-CS-NP的结合仅轻微影响Aly08的活性。

图2.固定藻酸盐裂解酶的低分子量壳聚糖纳米颗粒（ALLMW-CS-NPs）的分析。（A）AL-LMW-CS-NP的Aly08装载能力；（B）ALLMW-CS-NP的Aly08装载效率；（C）在（LMW-CS-NPs）之前和（AL-LMW-CS- NPs）Aly08加载之后的游离氨基百分比；（D）不同组的藻酸盐裂解酶活性％。

AL-LMW-CS-NPs的生化特性

对游离和固定的Aly08的特征进行了进一步分析。如图所示3A，游离的和固定的Aly08的酶促活性从15◦C开始增加，然后在45◦C达到峰值，然后随着温度的进一步升高而下降。结果，游离的和固定的Aly08都显示出在45◦C下的最佳温度。如图所示3B，游离的和固定的Aly08的最佳反应pH均为8.0。这些结果表明，将Aly08固定在LMW-CS-NP上不会影响其最佳温度和pH。

为了分析游离的和固定的Aly08的热稳定性的影响，将酶分别在37◦C和45◦C孵育不同时间（0–90 分钟）。如图所示4A，在37◦C孵育40分钟后，游离的Aly08迅速丧失了其初始活性的60％。然而，固定化的AL-LMW-CS-NP即使在相同温度下孵育1小时后仍保留其初始活性的76.8％。这些结果表明，固定化的Aly08在37◦C时显示出更高的稳定性，因为抗生物膜活性的测定始终在37◦C进行，因此可以诱导更好的抗生物膜活性。游离的Aly08和固定化的AL-LMW-CS-NP的最佳温度为45◦C，因此，对两种酶的热稳定性也在45◦C进行了分析

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