枯草芽孢杆菌WB800-pHA01-palI在生物膜反应器中绿色合成甘蔗糖蜜异麦芽酮糖外文翻译资料

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Food Chemistry 229 (2017) 761–768

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Food Chemistry

j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / f o o d c h e m

枯草芽孢杆菌WB800-pHA01-palI在生物膜反应器中绿色合成甘蔗糖蜜异麦芽酮糖

Lingtian Wu a,b,c, Shanshan Wu a,c, Juanjuan Qiu a,b,c, Chuanxue Xu b, Sha Li a,b, , Hong Xu a,b,

  1. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 5 Xin Mofan Road, Nanjing 210009, PR China
  2. College of Food Science and Light Industry, 30 South Puzhu Road, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, PR China
  3. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, 30 South Puzhu Road, Nanjing 211816, PR China

a r t i c l e i n f o

Article history:

Received 26 October 2016

Received in revised form 23 January 2017 Accepted 1 March 2017 Available online 2 March 2017

Chemical compounds studied in this article: Sucrose (PubChem CID: 5988) Isomaltulose (PubChem CID: 439559) Trehalulose (PubChem CID: 162104)

Keywords:

Sucrose isomerase

Heterologous expression

Food safety

Cane molasses

Isomaltulose

Biologic membrane reactor

a b s t r a c t

在酶催化的发展中，非常需要绿色过程和环境友好的过程。在这项工作中，构建了穿梭质粒pHA01，并在枯草芽孢杆菌WB800中表达了蔗糖异构酶（SIase）。 SIase表达的最佳氮源和碳源分别是酵母提取物（15 g / L）和未经预处理的甘蔗糖蜜（UCM，20 g / L）。加入UCM后，在7.5 L发酵罐中，整个细胞活性达到5.2 U / mL。整个电池的最佳催化温度和pH分别为35 LC和5.5。尽管生物膜反应器（BMR）系统连续工作了12批，但蔗糖转化率仍高于90％，表明BMR系统具有更高的运行稳定性。此外，使用以低成本甘蔗糖蜜为底物的BMR系统生产异麦芽酮糖，不仅降低了生产成本并介导了环境污染，而且还解决了非食品级菌株的遗传背景问题。

2017 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. 介绍

随着生活水平的提高和健康意识的发展，人们越来越注意饮食。 在甜味剂方面，人们更喜欢低卡路里和健康功能的食物，例如D-塔格糖，阿洛糖，异麦芽酮糖，L-阿拉伯糖和低聚果糖。 异麦芽酮糖是一种稀有的功能性糖，已获得美国食品和药物管理局的批准，并因其在食品添加剂领域的广阔应用前景而受到全世界的关注（Li等，2013； Mu，Li，Wang，Zhang ，＆Jiang，2014; Ravaud，Watzlawick，Haser，Mattes，＆Aghajari，2006）。 作为蔗糖的替代品，异麦芽酮糖具有许多健康优势，例如，降低胰岛素水平，预防蛀牙和血糖指数（Fleddermann等，2016； Mu等，2014）。 因此，异麦芽酮糖已被视为治疗糖尿病的肠胃外营养素（Hamada，2002）。

Corresponding authors at: State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 5 Xin Mofan Road, Nanjing 210009, PR China.

E-mail addresses: lisha@njtech.edu.cn (S. Li), xuh@njtech.edu.cn (H. Xu).

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.03.001 0308-8146/ 2017 Elsevier Ltd. All rights reserved.

异麦芽酮糖的合成通常涉及化学或酶促方法。化学方法总是伴随着某些副产物的形成和褐色，这增加了产物分离和纯化的难度。而且，这些困难增加了生产成本和能耗。因此，以蔗糖为底物，利用生物转化技术合成异麦芽酮糖已成为研究热点。此外，作为高效，绿色的生物催化剂，酶具有一定的优势，例如反应条件温和，易于加工和产物收率更高，这使得酶法在各个行业中都变得越来越重要（He，Xiang，Yang，＆Guan，2016 ; Jochems，Satyawali，Diels和Dejonghe，2011年）。到2012年，全世界酶业务的增长被认为价值约27亿美元（Jochems等，2011）。日益重要的原因是对可持续生产过程和生态友好型生物技术的主要需求。

许多菌株可能会产生SIase，例如鼠李糖欧文氏杆菌，红杆菌菌，粘质沙雷氏菌，肠杆菌属，克雷伯氏菌和嗜酸假单胞菌（De Oliva-Neto＆Menao，2009; Krastanov，Blazheva，＆Stanchev，2007; Li等，2011； Watzlawick＆Mattes，2009）。 SIase催化蔗糖作为底物的异构化成海藻糖和异麦芽酮糖。异麦芽酮糖的合成已在固定化的SIase和细胞中进行了广泛的研究（Li等，2013; Wu等，2015; Wu，Wu等，2016b）。然而，非食品级菌株的遗传背景限制了异麦芽酮糖生物合成的商业过程。 Park等。在乳酸乳球菌MG1363中表达SIase并在酿酒酵母表面上表达，从而在一定程度上改善了非食品级菌株的遗传背景问题（Lee等，2011； Park等，2010） 。然而，酿酒酵母和乳酸乳球菌MG1363合成的异麦芽酮糖显示出较低的蔗糖转化率（分别为7.4％和72％），这阻碍了其在食品工业中的使用（Lee等人，2011年； Park等人） （2010年）。使用纯酶可以防止非食品级菌株和产品的混合，但是纯化过程耗时，昂贵且被认为是不切实际的（Ishikawa，Shigemori和Hori，2014）。固定化

的酶和细胞都可以提高其稳定性和可重复使用性，但是阻碍酶催化反应发挥全部潜力的主要障碍包括扩散问题，酶的高成本和高技术成本（Barbosa等人，2014； Lozano，Bernal，Jara （＆Belleville，2014； Wu，Qiu等人，2016； Wu，Wu等人，2016）。据报道，固定在e-聚-1-赖氨酸修饰的介孔TiO2上的SIase半衰期只有114小时，不符合行业要求（Wu等人，2015）。介导非食品级菌株遗传背景的有效方法是提高食品安全宿主中SIase的表达效率。

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枯草芽孢杆菌是新颖产品和应用的有前途的来源，可以满足人类对功能性食品的需求。 枯草芽孢杆菌已被归类为“公认的安全”微生物（Harwood＆Wipat，1996）。 枯草芽孢杆菌是一种杆状，无创，无致病性的革兰氏阳性细菌，被认为是表达药学和工业相关蛋白质的合适候选药物（Forsyth等人，2013； Fowle，Fein， ＆Martin，2000; Guan et al。，2015; Yang，Song，Freudl，Mulchandani，＆Qiao，2010）。 枯草芽孢杆菌的表达系统是酶异源表达的理想细胞工厂（Chityala，Venkata Dasu，Ahmad和Prakasham，2015）。 目前，大多数商业酶均由枯草芽孢杆菌表达（Shao，Cao，Zhao，Tan和Feng，2015）。

餐厨垃圾会向环境产生大量排放物，有可能影响未来的粮食安全（Hamilton，Peverill，Muuml;ller和Bratteboslash;，2015年； Han等人，2015年）。解决食物浪费的常见策略包括预防和回收（Hamilton等，2015）。尽管可通过有效手段减少粮食浪费，但由于生命的存在，总是产生粮食浪费；厨余回收可能最终成为解决问题的方法。蔗糖蜜（CM），制糖业的废料，由蔗糖（45％，w / v），葡萄糖（5％，w / v）和果糖（5％，w / v），悬浮的重金属组成，含氮化合物，胶体和维生素（Li等人，2013； Xia等人，2014）。作为廉价的原料，它可用于许多工业化学品的生产，例如乳酸（Kotzamanidis，Roukas和Skaracis，2002年），乙醇（Ergun和Ferda Mutlu，2000年），柠檬酸（Jianlong，Xianhua和Ding， 2000年）和e-poly-L-赖氨酸（Xia等人，2014年）。据我们所知，CM从未被枯草芽孢杆菌用于异麦芽酮糖的生产。

此外，在某些产品的生物催化合成中与膜分离系统耦合可能是一个很好的策略（Jochems等，2011）。膜分离系统已应用于废水处理，微咸水或海水淡化，药物浓缩和食品加工。该系统可以实现节能和减排，与可持续发展战略相匹配。生物膜反应器（BMR）是一种用于工业生产的实用系统，可允许酶或细胞再利用和完全回收，特别是与下游加工结合使用时（Jochems等，2011; Lozano等，2014; Xu，高王＆肖，2014）。作为生物技术中最流行的方法之一，BMR已成功地应用于多糖的连续酶水解，例如纤维素，果胶和淀粉（Lozano，Manjon，Romojaro，Canovas和Iborra，1987; Lozano等，2014） ； Paolucci-Jeanjean，Belleville和Rios，2001年）。因此，BMR因其提供出色的生物柴油产量和高质量生物柴油的能力而受到关注（Xu等人，2014）。

为了获得高表达SIase的GRAS菌株，成功构建了可诱导的穿梭质粒pHA01。因此，通过化学转化将重组质粒pHA01-palI转化到枯草芽孢杆菌WB800中。为了获得枯草芽孢杆菌WB800中SIase的过量生产，在摇瓶中优化了培养基成分（碳和氮源）。在最佳条件下，在7.5 L发酵罐中进行SIase的表达。此外，针对异麦芽酮糖的合成优化了最佳的催化反应条件，包括温度，pH和细胞用量。为了克服环境污染和资源循环利用的问题，绿色化学引起了极大的关注（Deplanche等人，2014）。与聚合物膜相比，陶瓷膜具有独特的优势，例如更高的化学，机械和热稳定性以及更低的生命周期成本（Wang，Hou，＆Lin，2016）。因此，使用BMR系统进行了半成功的酶催化反应，该系统搭载了以预处理的甘蔗糖蜜（PCM）为底物的异麦芽糖生产用陶瓷膜分离系统，从而提高了CM的经济价值并解决了CM的环境污染问题。获得的结果可能对实现食品工业中异麦芽酮糖的生产非常有用。

2. 材料和方法

2.1. 材料

蔗糖，异麦芽酮糖，卡那霉素（Km），氨苄青霉素，乙二醇四乙酸乙二醇酯和溶菌酶由Aladdin工业有限公司（中国南京）提供。 Phanta超保真DNA聚合酶和ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒由Vazyme Biotech Co.，Ltd.（中国南京）提供。 限制酶，T4 DNA连接酶，DNA标准标记和预混合蛋白标记（低）购自Takara Biotechnology Co.，Ltd.（中国大连）。 大肠杆菌DH5a和枯草芽孢杆菌WB800保存在我们的实验室中。 甘蔗糖蜜购自桂林糖厂（中国广西）。 所有其他化学药品和试剂均购自Sigma Chemical Co.，Ltd.（中国上海）。lt;

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