通过在工程化谷氨酸棒杆菌S9114中系统操作L-ornithine代谢来提高L-ornithine产量外文翻译资料

 2022-08-06 11:47:19

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通过在工程化谷氨酸棒杆菌S9114中系统操作L-ornithine代谢来提高L-ornithine产量

张斌；任李全；于淼；周莹；叶邦策

摘要

L-Ornithine是一种非蛋白质氨基酸，在医药和食品工业中有广泛的应用。目前，L-ornithine是通过微生物发酵生产的；然而，就L-鸟氨酸的生产率和成本降低而言，该方法需要进一步改进。在该研究中，观察到LysE的过表达增加了工程化谷氨酸棒杆菌S9114的ʟ-ornithine产量。为了克服使用质粒表达LysE的缺点，在染色体的lysE上游区域插入了一个强启动子Ptac。通过减弱ncgl2228和proB的表达，并增强gdh和argCJBD的表达，进一步改造了该菌株。这些目标的组合导致ʟ-ornithine产量为25 g/L，比原始菌株(15.3 g/L)的产量高63.4%。这些结果证明了过量表达LysE对ʟ-ornithine生产的积极作用，并为开发ʟ-ornithine-producing谷氨酸棒状杆菌菌株提供了新的靶标。

关键词:谷氨酸棒杆菌，ʟ-ornithine，代谢工程

介绍

L-Ornithine，这是一种非蛋白质氨基酸和尿素循环重要的组成部分，尿素循环广泛用于治疗和预防肝病(Salvatore等人，1964)，促进伤口愈合，并支持心脏健康(Shi等人，2002)。作为ʟ-citrulline和ʟ-arginine的前体，ʟ-ornithine是通过谷氨酸棒杆菌中的四步酶促反应由谷氨酸合成的。谷氨酸棒状杆菌是在有氧条件下培养的，并且已经显示出优于其他工业微生物(例如大肠杆菌和其他棒状杆菌属)。)生产有价值的代谢物的能力。除了谷氨酸，它还产生其他氨基酸，如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸(Anusree等人，2016；Lee amp; Wendisch，2017；Li等人，2017年；Lubitz amp; Wendisch，2016年)，二胺，如腐胺(Meiswinkel等人，2013年b；Schneider amp; Wendisch，2010年)和尸胺(Mimitsuka等人，2007年)，以及二羧酸如琥珀酸(Chen等人，2014年；Jo等人，2017年；Lee等人，2014年；史等，2014)。在这一途径中，将ʟ-glutamate转化为ʟ-ornithine的四种酶(即ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD)被转录为操纵子。值得注意的是，它们的表达被转录调节蛋白ArgR抑制(Yim等，2011)。

最近，为了提高ʟ-ornithine的微生物生产力，由于营养缺陷型表型的频繁逆转，导致l-鸟氨酸的含量显著降低，传统的诱变方法已经逐渐被基因工程方法所取代。几项研究报告了在这方面取得的相当大的进展用于ʟ-ornithine生产的谷氨酸棒状杆菌工程菌株的开发(Meiswinkel等人，2013年a；Schneider等人，2011年；Wendisch等人，2016年)。Jiang等人报道了一种工程化谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032衍生菌株，其失活argF、proB和speE，以及NADH依赖性谷氨酸盐的过表达来自枯草芽孢杆菌的脱氢酶，在摇动中产生14.8克/升ʟ-ornithine烧瓶培养(蒋等，2013b)。在Jiang等人的另一项研究中，24.1克/升ʟ-ornithine是由一种来源于工程谷氨酸棒状杆菌菌株适应性进化的菌株产生的(Jiang等人，2013年a)。Jensen等人通过过表达gdh和argCJBD并缺失argFRG，系统地开发了谷氨酸棒状杆菌突变株，该突变株在含有4% (w/v)葡萄糖、100 g/mL壮观霉素和0.25 mM精氨酸的CgXII培养基中每g葡萄糖产生0.524g ʟ-ornithine(Jensen等人，2015年)。Hwang和Cho报告了一个重组菌株，其失活了三个假定的葡萄糖脱氢酶基因，以增加氨基酸生物合成途径的NADPH供应，这将ʟ-ornithine的产量提高到14 g/L (Hwang amp; Cho，2014年)。Kim等人通过破坏proB、argR和argF，并过表达谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831的操纵子argCJBD，开发了重组谷氨酸棒状杆菌菌株。该菌株在6.6升发酵罐中使用补料分批培养方法从葡萄糖产生51.5克/升ʟ-ornithine(Kim等人，2015年)。

在先前的研究中，报道了突变菌株(谷氨酸棒状杆菌S9114asymp;ArgFasymp;ncg 1221asymp;ArgRasymp;PutP ODhA 800 PEc-lysE)的构建。该菌株在72小时的摇瓶培养过程中产生高达18.4克/升的ʟ-ornithine(Zhang等人，2017年)。在本研究中，描述了用于产生高水平ʟ-ornithine的基因工程谷氨酸棒状杆菌菌株的开发。使用缺失、间变性，和启动子插入实验。此外，插入proB和ncgl2228上游的转录终止子，以及过表达通过插入强Peftu启动子对gdh的ʟ-ornithine产量进行了评估。

材料和方法

2.1微生物、质粒和引物

谷氨酸棒状杆菌S9114衍生的ʟ-ornithine-producing菌株orn1 (S9114，argF缺失)和orn8 (S9114，argF、ncgl1221、argR和putP缺失，odhA被RBS800衰减)被用作ʟ-ornithine生产的亲本菌株，如前所述(Zhang等人，2017)。本研究中构建的所有菌株和质粒列于表1。大肠杆菌菌株DH5alpha;被用作分子操作的克隆宿主。

DNA操作和菌株构建

为了构建突变菌株，分离谷氨酸棒状杆菌S9114的基因组DNA，并将其用作扩增特定基因的模板。如前所述(Shauml; fer等人，1994)，来自枯草芽孢杆菌的具有蔗糖筛选标记sacB的自杀载体pK18mobsacB通过双交叉重组用于无标记基因缺失、基因插入和启动子插入。

为了在谷氨酸棒状杆菌S9114中插入启动子，使用聚合酶链式反应(聚合酶链反应)扩增lysE、gdh和argC的上游片段(核糖体结合位点上游约1000 BP)和下游片段(核糖体结合位点下游约1000 BP)。以谷氨酸棒状杆菌S9114的基因组DNA为模板，通过聚合酶链反应也扩增了强启动子Peftu。强启动子Ptac被插入到扩增的下游使用特异性引物进行片段化。随后，上游片段、启动子和下游片段重叠并插入到通过吉布森组装，从而产生重组质粒pK18-PtaclysE、pK18-Peftugdh和pK18-PeftuargC。为了在谷氨酸棒状杆菌S9114中插入终止子，proB和ncgl2228的上游片段(翻译起始密码子上游约1000 BP)和下游片段(翻译起始密码子下游约1000 BP)用聚合酶链反应进行扩增和融合。使用特异性引物将终止子插入上游和下游片段的重叠区域。随后，使用重叠聚合酶链反应将含有终止子的上游和下游片段结合，并通过Gibson装配将重组片段插入到pK18mobsacB的HindIII/XbaI位点，从而产生重组质粒pK18-T-proB和pK18-T-ncgl2228。使用电穿孔将所有重组质粒转化到谷氨酸棒状杆菌S9114和谷氨酸棒状杆菌S9114衍生的菌株中。经过两轮同源重组后，使用菌落聚合酶链反应鉴定突变体。

2.3发酵条件和媒介

鲁利亚-贝尔塔尼培养基用于繁殖大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌。对于ʟ-ornithine发酵试验，每个突变体的单个克隆在LB琼脂平板上活化12小时的两个循环。随后，将细菌培养物接种到100ml常规摇瓶中的10 mL种子培养基中。每升种子培养基由25 g葡萄糖、10 g酵母提取物、10 g玉米浆、15 g(NH4)2SO4、2.5克硫酸镁7H2O、1克磷酸二氢钾、0.5克磷酸氢钾、0.5克磷酸氢二钠和10克碳酸钙。在32℃和220转/分下培养11小时后，加入适量的将培养物转移到存在于250毫升挡板摇瓶中的24毫升发酵培养基中烧瓶。发酵培养物在600纳米处的初始光密度为调整为1。每升发酵培养基由100克葡萄糖、20克玉米浆、50克(NH4)2SO4、2.5克硫酸镁7H2O、1克磷酸二氢钾、0.5克磷酸氢钾、0.5克磷酸氢二钠、0.02克硫酸亚铁7H2O、0.02克硫酸锰4H2O和10克碳酸钙。将酸碱度调至7。所有培养物在32℃和250 rpm下生长，每隔12小时收集样品(200 L ),以测量ʟ-ornithine浓度、细胞密度和残余葡萄糖浓度。如果需要，将50毫克/升卡那霉素加入大肠杆菌的培养基中，将12.5毫克/升卡那霉素加入谷氨酸棒状杆菌的培养基中。

2.4逆转录聚合酶链反应

为了提取核糖核酸，在培养后12小时收集500升发酵样品。使用核糖核酸制备纯细胞/细菌试剂盒(中国北京天根生物技术有限公司)提取总核糖核酸。使用琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖，1%)分析核糖核酸的完整性，并使用微孔板读取器(BioTek Instruments，Winooski，VT，USA)测定其浓度。使用带有gDNA橡皮擦的PrimeScript逆转录试剂盒(日本志贺县TaKaRa Bio)进行逆转录。如前所述进行逆转录聚合酶链反应分析(廖等，2015年)。

2.5细胞生长分析和发酵产物的定量

之后，通过使用微孔板读取器测量OD600来监测细胞生长将碳酸钙溶解在0.125摩尔/升盐酸中。发酵上清液通过0.22- m过滤器，并分析葡萄糖、谷氨酸盐和乳酸盐的浓度使用SBA-40C生物传感器(由山东生物研究所开发科学院)。ʟ-ornithine浓度用比色法测定如前所述，使用茚三酮(Jiang等人，2013bRosen，1957)。这分析发酵上清液中18种标准氨基酸的浓度使用自动L8900氨基酸分析仪(日立高科技公司，东京，日本)。所有实验分三次进行，数据表示为平均标准偏差。

3结果与讨论

3.1 lyse的缺失和过度表达对ʟ-ornithine生产产生相反的影响

LysE是一种ʟ-lysine转运蛋白，也转运ʟ-citrulline和ʟ-arginine，但不转运ʟ-ornithine (Bellmann等人，2001年)。LysE的缺失导致ʟ-lysine的低分泌，这可以为ʟ-isoleucine生产节省前体和NADPH(dong等人，2016年)。因此，lysE被破坏以阻断ʟ-lysine转运，这可能减少ʟ-ornithine-producing菌株orn1中ʟ-ornithine生物合成的NADPH消耗，从而产生新的突变菌株orn2。与预期相反，在发酵培养基中培养菌株orn1和orn2 72小时后，orn 2产生4.37克/升ʟ-ornithine，这表明与在orn1 (7.2克/升)中观察到的相比，鸟氨酸产量减少了39.3%(图1A)。在发酵过程中，orn2被观察到是一个健壮的菌株，因为它的生长不受lysE缺失的影响(图1B)。为了研究lysE的过表达是否提高了ʟ-ornithine产量，构建了在其天然启动子下表达lysE的基于pEC-XK99E的重组质粒，并将其转化到orn1和orn2中，从而分别产生菌株orn5和orn6。空的pEC-XK99E载体也被转化成orn1和orn2，从而分别产生菌株orn3和orn4作为对照。如图1C所示，菌株orn5和orn6产生8和7.8克/升ʟ-ornithine，分别比对照菌株orn3 (7克/升)高13%和11%，高95%和90%比orn4 (4.1克/升)分别产生的更多。这些菌株的生长不是受这些调制的影响(图1C)。因此，氨基酸转运体LysE是观察到在ʟ-ornithine生产中发挥重要作用，这进一步证实以前的研究发现，lysE的过表达提高了ʟ-ornithine的产量重组谷氨酸棒状杆菌S9114(张等，2017)。Bellmann等人报告说在短期发酵实验中，LysE不能在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中运输ʟ-ornithine(bellmann等人，2001年)。除了通过LysE过表达增强ʟ-ornithine转运外，它不能排除其他未知机制可能有助于增加ʟ-ornithine.的积累尽管这一现象的细节尚不清楚，但本研究通过缺失和基于质粒的过表达分析提供了直接证据，表明裂解表达对ʟ-ornithine生产有积极影响。

3.2通过在染色体上插入启动子来增强LysE的表达，以提高ʟ-ornithine产量

在以前的研究中，通过缺失argF、ncgl1221、argR和putP，减弱odhA和基于质粒的lysE过表达构建了high-ʟ-ornithine-producing菌株(Zhang等人，2017年)。然而，基于质粒的lysE过表达存在几个问题，例如遗传不稳定性和需要插入抗生素抗性盒，这干扰了后续的工程步骤。因此，为了解决上述问题，将一个强突变型tac启动子(吕特等人，2014年)插入到lysE的上游区域以增强其表达，从而产生菌株orn9。如图2A所示，与对照菌株orn7，菌株orn8中lysE的mRNA水平增加了约3.22倍，这表明通过插入成功上调了LysE的表达突变启动子的基因。在72小时的摇瓶发酵过程中，该工程菌株ʟ-ornithine产量高达19克/升，比2000年的产量高出24.1%菌株orn7(从葡萄糖中产生高达15.3克/升的ʟ-ornithine)(图2B)。通过替换lysE启动子，细菌葡萄糖消耗也略有改善(图2 D)。这些发现表明，lysE表达的调节导致了ʟ-ornithine产量的提高，同时保持了生物体以类似于对照菌株在类似发酵条件下观察到的速率生长和消耗葡萄糖的能力。通过将一种强启动子Ptac插入染色体上lysE的上游区域，成功解决了在基于质粒的lysE过表达系统中观察到的遗传不稳定性和抗生素添加问题，这些问题阻碍了衍生菌株的产生。这项工作强调了在开发ʟ-ornithine-producing菌株时LysE过表达的重要性。

3.3通过使用终止子插入策略减弱ncgl2228的表达来提高ʟ-ornithine产量

在使用ʟ-ornith

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