改善地衣芽孢杆菌中甘油的分解代谢，以生产聚γ-谷氨酸外文翻译资料

 2022-08-07 14:28:47

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改善地衣芽孢杆菌中甘油的分解代谢，以生产聚gamma;-谷氨酸

摘要

地衣芽孢杆菌WX-02是一个经过充分研究的菌株，可用于生产多种应用的聚gamma;-谷氨酸（gamma;-PGA）。这项研究旨在通过代谢操纵提高WX-02的吸收甘油能力，甘油是生物燃料行业的主要副产物。通过基因敲除，GlpK途径被确定为唯一的功能性甘油分解代谢途径，而DhaK途径在有氧或无氧条件下对该菌株均无活性。尝试通过分别用组成型启动子（P43），ytzE启动子（PytzE）和bacABC操纵子启动子（PbacA）取代天然glpFK启动子来提高甘油的利用率。相应突变菌株WX02-P43glpFK，WX02-PytzEglpFK和WX02-PbacAglpFK的甘油消耗量分别比WX-02菌株高30.9、26.42和18.8％。 这三种突变菌株产生的gamma;-PGA浓度分别比WX-02菌株高33.71％，23.39％和30.05％。当使用源自生物柴油的粗甘油作为碳源时，突变体WX02-P43glpFK产生了16.63 g L-1的gamma;-PGA，产率为0.35 g L-1 h-1。 总体而言，该研究表明甘油可以用作代谢工程地衣芽孢杆菌菌株产生gamma;-PGA的有效底物。

关键词：地衣芽孢杆菌 粗甘油 聚gamma;-谷氨酸 启动子置换

介绍

聚-gamma;-谷氨酸（gamma;-PGA）是一种天然存在的生物聚合物，由D-和L-谷氨酸单体组成，它们通过alpha;-氨基和gamma;-羧酸基团之间的酰胺键连接（Luo等2016; Ogunleye等.2015）。gamma;-PGA的产生可以基于化学合成，酶促合成和微生物发酵（Sanda等，2001）。在这些方法中，微生物发酵最具成本效益，并具有许多优势，例如使用廉价的原料，最终产品的高纯度，反应条件温和且环境友好（Luo等，2016）。由于gamma;-PGA具有水溶性，可生物降解，无毒和可食用的特性，因此已被用于各个领域，例如食品工业中的增稠剂，化妆品中的保湿剂，医疗领域中的药物载体和组织工程，絮凝剂和用于废水处理的重金属吸收剂和农业肥料（Bajaj和Singhal，2011； Shih等，2002；Wang等，2008）。

gamma;-PGA的发酵生产通常通过芽孢杆菌属物种（例如炭疽芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌）实现（Bajaj和Singhal2011）。在那些物种中，地衣芽孢杆菌是有前途的gamma;-PGA生产者，因为它通常被认为是安全的（GRAS）菌株。地衣芽孢杆菌WX-02菌株作为gamma;-PGA的有效生产者，已经被进行了广泛研究（Li等人2014; Tian等人2014; Wang等人2016; Wei等人2010）。除gamma;-PGA产生外，地衣芽孢杆菌还可用作酶，氨基酸，抗生素，生物燃料和其他次级代谢产物的表达平台（Qiu等人，2016）。

gamma;-PGA的微生物生产通常使用葡萄糖作为发酵底物（Luo等人，2016）。使用甘油作为微生物gamma;-PGA生产的底物可能是一个有前途的选择，尤其是当甘油可以作为生物柴油行业的副产品获得时（Mattam等，2013）。生物柴油衍生的粗甘油被认为是低价值的，甚至是具有处置挑战的废料（Dobson等，2012）。由于将粗甘油精制为高纯度产品并不经济，因此使用粗甘油作为发酵gamma;-PGA生产的底物提供了利用这种大量副产物的机会（Dobson等人，2012）。杜等。 （2005年）报道甘油可以影响细胞膜磷脂及其酯连接的脂肪酸的生物合成，从而导致更好的膜通透性，从而增强gamma;-PGA的分泌。实际上，甘油已被用作葡萄糖与葡萄糖的共底物，用于地衣芽孢杆菌ATCC 9945a，枯草芽孢杆菌NX-2和枯草芽孢杆菌CGMCC0833的细胞生长和gamma;-PGA产生（Ko and Gross 1998; Wu et al.2008，2010）。

当使用甘油作为碳源时，已经报道了几种能够生长和合成gamma;-PGA的地衣芽孢杆菌菌株（Cromwick等，1996； Du等，2005； Shih等，2002）。众所周知，甘油转运促进剂（GlpF）促进微生物通过细胞膜吸收甘油（例如大肠杆菌（Murarka等，2008），恶臭假单胞菌（Nikel等，2014），粪肠球菌（Bizzini等，2010）等细胞膜吸收。 ）和枯草芽孢杆菌（Darbon et al。2002）。甘油分解代谢通常涉及两个途径。 一种是在大肠杆菌中发生的GlpK途径（有氧或呼吸途径）（Murarka等，2008）。此途径始于ATP依赖性甘油激酶（GlpK），将甘油转化为3-磷酸甘油（glycerol-3-P），后者被氧化为磷酸二羟基丙酮（DHAP）（图 1）。另一个是发生在弗氏柠檬酸杆菌中的DhaK途径（厌氧或发酵途径）（Yazdani和Gonzalez 2007）。该途径始于NAD 依赖性甘油脱氢酶（GldA）催化甘油生成二羟基丙酮，然后DHA激酶（DhaK）将其磷酸化为DHAP（Bizzini等人2010; Nikelet等人2014）（图1）。然而，对于地衣芽孢杆菌，甘油的分解代谢途径仍是未知的。在地衣芽孢杆菌中使用粗制甘油的吸引力需要对该物种的甘油代谢进行详细的研究，然后这将为使用代谢工程方法提高地衣芽孢杆菌的甘油摄取和gamma;-PGA产生提供指导。这项研究的目的是鉴定负责地衣芽孢杆菌WX-02菌株甘油同化的基因，并开发代谢工程方法以提高该菌株的gamma;-PGA产量。

图 1甘油利用的两种分解代谢途径。 GlpK，甘油激酶； GlpD，3-磷酸甘油脱氢酶； GldA1 / 2，甘油脱氢酶； DhaK，二羟基丙酮激酶

材料和方法

细菌菌株，质粒和生长条件

表1列出了这项工作中使用的细菌菌株和质粒。 大肠杆菌DH5alpha;用于克隆;地衣芽孢杆菌WX-02菌株（CCTCC M208065）用作初始菌株（Wei等人2010）。大肠杆菌DH5alpha;和地衣芽孢杆菌菌株在Luria Bertani（LB）培养基中于37°C下生长。 固体培养基包含18 g L-1琼脂。必要时，在大肠杆菌和地衣芽孢杆菌培养物中添加20 mg mL-1卡那霉素，100 mg mL-1氨苄青霉素和20 mg mL-1四环素。

地衣芽孢杆菌种子会在含有50 mL LB培养基的250 mL烧瓶中生长。 将烧瓶在180rpm的旋转振荡器中保持在37℃。库珀的基本培养基用于经过微小改动的生长实验（Qiu等，2014）。介质由（每升）5 g NH4NO3、60 mmol KH2PO4、80 mmol Na2HPO4、0.2 mmol MnSO4·H2O，0.8 mmol MgSO4·7H2O，7mu;molCaCl2和4mu;molNa2-EDTA组成。培养基中添加了2％（wt / vol）甘油作为唯一碳源。在有氧条件下用250 mL锥形瓶进行实验，在37°C（180 rpm）的条件下剧烈搅拌培养培养物。在静态条件下，在用橡皮塞密封的30 mL玻璃管中进行厌氧培养（Bizzini等，2010）。两种培养系统均接种了2％（v / v）种子培养物，并含有30 mL库珀培养基。

用于生产gamma;-PGA的培养基包含（每升）50克甘油，12克柠檬酸，30克谷氨酸钠，8克氯化铵，1克K2HPO4·3H2O，1克MgSO4·7H2O，1克ZnSO4·7H2O，1克 CaCl2和0.15 g MnSO4·H2O。 在115℃高压灭菌之前，将培养基的pH调节至7.2。然后在250 mL锥形瓶（50 mL工作体积）中用3％（v / v）种子培养物接种培养基，并在37°C的旋转摇床中以180 rpm孵育48小时。

生物柴油衍生的粗甘油购自中国河北龙海生物燃料有限公司。用去离子水以1：4的比例（v / v）稀释粗甘油流（含82％甘油，v / v），然后用活性炭（每100 mL稀释溶液1.5 g活性炭）处理。将混合物在60℃下搅拌30分钟，并以12,000rpm离心5分钟。 然后将上清液通过滤纸过滤以除去任何残留的颗粒。 分析所得滤液的甘油浓度。

表 1不同地衣芽孢杆菌菌株细胞生长，甘油消耗和gamma;PGA产生的比较

菌株在含有50 mL培养基的250 mL烧瓶中生长，并在180 rpm的旋转摇床中于37°C孵育48 h。 初始甘油浓度为50 g L-1。 数据表示为三个重复的平均值plusmn;SD

染色体基因的缺失和启动子的替换

表S2列出了用于染色体操作的引物。 按照我们先前报道的方案进行QlP，glpD，gldA1，gldA2和dhaK基因的删除，并用P43，PytzE或PbacA替换glpFK操纵子的天然启动子（Qiu等人，2014,2016）。T2（2）-ori载体用于基因缺失和启动子替换（Qiu等人，2014）。从枯草芽孢杆菌168，地衣芽孢杆菌WX-02和地衣芽孢杆菌DW2（CCTCCM2011344）分别扩增P43，PytzE和PbacA启动子。通过剪接重叠延伸PCR（SOEPCR）构建重组片段。将融合片段转化到T2（2）-ori载体中，产生重组质粒，该重组质粒通过电穿孔转化到地衣芽孢杆菌WX-02菌株中（Xue et al。1999）。将阳性转化子在含有卡那霉素的LB培养基中于45°C孵育8 h，然后在含有卡那霉素的LB琼脂上划线8 h以获得单交换重组体。选定的单交叉克隆体在LB培养基中于37°C进行连续传代培养，以促进同源重组。 使用相应的引物（表S2）通过PCR验证了两次交换事件产生的卡那霉素敏感菌落，并通过DNA测序验证了基因缺失的克隆和启动子置换的克隆

WX-02Delta;glpK和WX-02Delta;glpD菌株的补充实验

为了补充突变菌株WX-02Delta;glpK和WX-02Delta;glpD，在穿梭载体pHY300PLK中分别表达了glpK和glpD（Qiu等人2016）。从枯草芽孢杆菌168基因组DNA扩增出P43启动子，而从地衣芽孢杆菌WX-02基因组DNA扩增出glpK，glpD和amyL基因的终止子。通过SOE-PCR融合P43启动子，基因片段和终止子，产生融合片段P43-glpK-TamyL和P43-glpD-TamyL，然后分别插入EcoRI / XbaI切割的pHY300PLK中以形成质粒pHY -glpK和pHY-glpD。表达载体pHY-glpK和pHY-glpD被转化为相应的突变体。 通过PCR和DNA测序验证具有四环素抗性的阳性转化体

转录分析

根据先前报道的方法进行转录分析（Wang等，2016）。WX-02，WX02-P43glpFK，WX02-PytzEglpFK和WX02-PbacAglpFK的生物量在烧瓶中培养24小时后收获，并用TRIzolreg;试剂（美国，Invitrogen）进行RNA提取。使用DNase I酶（日本TaKaRa）按照制造商的说明消化DNA，并使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo，USA）扩增cDNA的第一部分。实时PCR使用SYBRreg;Select Master Mix（美国ABI）按照制造商的说明进行。表S3中列出的引物用于扩增基因，地衣芽孢杆菌WX-02菌株的16S rRNA用作参考基因以使数据标准化。标准化后，将重组菌株的表达水平与野生型菌株进行比较。 所有测定一式三份进行。

分析程序

为了确定细胞的生长，将发酵液在12,000 rpm下离心10分钟，将分离的细胞重悬于蒸馏水中，然后用分光光度计（Bio-Rad，USA）在600 nm处的吸光度进行测定。使用SBA-40C生物分析仪（中国科学院，山东）测定谷氨酸浓度（Li等，2014）。gamma;-PGA的浓度使用凝胶渗透色谱（GPC）系统根据以前的方法确定（Wang等人2016）。简而言之，使用TSK Gel G6000 PWXL凝胶渗透色谱柱（7.8 mmtimes;300 mm，Tosoh，Tokyo，Japan），用25 mmol L-1硫酸钠溶液：乙腈（8：1）的混合物洗脱样品 ）以0.5 mL min-1的流速在220 nm下检测到。 gamma;-PGA通过外标定量。

为了确定甘油浓度，柠檬酸浓度和其他代谢物含量，将培养物用乙醇适当稀释，并将混合物涡旋混合，然后以12,000 rpm离心10分钟以去除细胞和gamma;-PGA。然后将上清液通过孔径为0.22mu;m的Millipore膜过滤。 将所得的含有乙缩醛和2,3-丁二醇（2,3-BD）的滤液转移至GC小瓶中，以进行进一步的GC分析（Agilent，美国）。通过先前描述的气相色谱法（Qi等人，2014）测定乙缩醛和2,3-BD的浓度。 有机酸（柠檬酸，乙酸和乳酸）的浓度通过先前报道的高效液相色谱（HPLC）方法测定（Qiu等人，2016）。滤液中的甘油通过带有蒸发光散射检测器（ELSD，安捷伦，美国）的HPLC系统（Inertsil NH2色谱柱）（250 mmtimes;4.6 mm，5mu;m; GL Science Tokyo，日本）进行定量。在30°C下用乙腈-水（4：1，v / v）以1 mL min-1流速洗脱该色谱柱。 将ELSD设置为50°C的漂移管温度和1.6 L min-1的雾化器气流。 甘油由外标确定。

统计分析

所有实验均一式三份进行。 数据表示为平均值plusmn;标准差。通过ANOVA评估差异的显着性

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