由解淀粉芽孢杆菌产生的杆菌霉素D与植物病原真菌禾谷镰孢镰刀菌拮抗相互作用外文翻译资料

 2022-08-08 10:01:02

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由解淀粉芽孢杆菌产生的杆菌霉素D与植物病原真菌禾谷镰孢镰刀菌拮抗相互作用

秦谷，杨洋，袁启明，史光明，吴立明，楼志颖，霍蓉，吴慧君，雷纳·鲍里斯，b雪文·高阿南京农业大学植物保护学院植物病理系，南京农业大学重点实验室教育部作物病虫害综合管理，南京华纳; 柏林洪堡大学生物学研究所，德国柏林b

摘要：禾谷镰刀菌（镰刀菌：Ascomycota，Hypocreales，Gibber ella，Gibberella zeae）是一种破坏性真菌病原体，威胁到生产和全球小麦和大麦的质量。 控制这种产生毒素的致病原是一项重大挑战。 在本研究中，市售菌株解淀粉芽孢杆菌（细菌，菌毛，芽孢杆菌，芽孢杆菌）FZB42对禾谷镰刀菌显示强活性。 由FZB42产生的脂肽杆菌霉素D被证明有助于抗真菌活性。 纯化的杆菌霉素D表现出对禾谷镰刀菌的强活性，测定其50％有效浓度约为30 g / ml。使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜进行的分析表明，杆菌霉素D导致禾谷镰刀菌菌丝和分生孢子的质膜和细胞壁发生形态变化。荧光显微镜结合不同的染料显示，杆菌霉素D诱导了禾本科镰刀菌菌丝和分生孢子中活性氧的积累并导致细胞死亡。禾谷镰刀菌的次级代谢也通过增加脱氧新戊酸的产量来响应芽孢杆菌素D的挑战。生物防治实验表明，芽孢杆菌素D对玉米丝，小麦幼苗和小麦头上的禾谷镰刀菌具有良好的控制作用。响应于杆菌霉素D，参与清除活性氧物种的禾谷镰孢基因被下调，而参与脱氧雪腐烯醇合成的基因被上调。 MGV1和HOG1，即禾谷镰刀菌的促分裂原活化蛋白激酶的磷酸化，响应于细菌霉素D而增加。这些发现共同揭示了细菌霉素D的抗真菌作用机理。

重要：由禾谷镰刀菌引起的植物病害的生物防治是理想的。 解淀粉芽孢杆菌FZB42是生物防治细菌菌株的代表。 在这项工作中，由FZB42生产的脂肽杆菌霉素D对禾谷镰刀菌显示出很强的杀真菌活性。 杆菌霉素D引起禾本科镰刀菌质膜和细胞壁的形态变化，引起活性氧的积累，并最终导致禾本科镰刀菌死亡。 有趣的是，当禾本科镰刀菌受到杆菌霉素D的攻击时，禾本科镰刀菌的脱氧雪腐烯醇产量，基因表达，丝裂原活化的蛋白激酶磷酸化和致病性显着改变。 这些发现阐明了杆菌霉素D对抗禾本科镰刀菌的活性的机制，并突出了解淀粉芽孢杆菌FZB42作为针对禾本科镰刀菌的生物防治剂的潜力。

关键词：真菌-细菌相互作用，解淀粉芽孢杆菌，禾谷镰刀菌，芽孢杆菌霉素D，活性氧，细胞死亡，丝裂原激活的蛋白激酶

丝状真菌镰刀镰刀菌（Fusarium graminearum Schwabe）会引起小麦和大麦的镰刀菌病，玉米的茎秆和耳腐病，玉米和小麦的幼苗病（1）。除严重的产量损失和谷物品质下降外，禾本科镰刀菌还可以在受侵染的谷物中产生几种真菌毒素，例如脱氧雪腐烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮。这些代谢物代表着对动物健康的重大威胁（2、3）。尽管FHB对经济和健康产生巨大影响，但尚无高抗性小麦或大麦品种可用（4，5）。实际上，FHB的管理很大程度上依赖于合成的抗真菌gal剂，例如苯并咪唑类杀菌剂（6、7）。但是，持续使用这些合成的抗真菌剂导致出现了耐药性禾本科镰刀菌，这对环境和人类健康构成了潜在的风险（7-9）。因此，必须开发出毒性低，环境友好的替代方法和试剂，以有效控制FHB。其中，对环境和生态系统友好的生物防治剂在全世界引起了越来越多的关注（10）。

生活在植物根部内或附近的植物生长根瘤菌（PGPR）可以抑制土壤传播的植物病原体并促进植物生长。这些有益的生物活性导致许多PGPR菌株作为可控制植物病害的商业生物防治剂而发展（11）。其中，来自芽孢杆菌属的某些物种作为PGPR的典型代表，被认为是开发高效生物防治剂的最佳人选，因为它们产生多种生物活性化合物，并且具有形成高度逆境抗性内生孢子的能力（ 10）。它们的保护作用可能依赖于通过刺激植物诱导的系统抗性和促进生长（13）直接或间接拮抗病原体生长的不同机制。此外，芽孢杆菌还可以与植物病原体竞争营养，尤其是铁，这是植物保护的另一个重要因素（13）。有几种基于芽孢杆菌的商业产品可供使用，例如Quantum-400（枯草芽孢杆菌GB03），小夜曲（枯草芽孢杆菌QST713）和根瘤菌（解淀粉芽孢杆菌FZB42）（14、15）。

淀粉芽孢杆菌FZB42，现更名为淀粉芽孢杆菌亚种。 plantarum FZB42是革兰氏阳性PGPR的模型菌株（16）。 FZB42以其有效的根际定植，促进植物生长的特性以及抑制不同植物病原体的能力而闻名（17、18）。基因组分析表明，FZB42中的10个基因簇覆盖了整个基因组的近10％，是产生具有抗微生物和杀线虫活性的次生代谢产物的原因（10）。这些次级代谢产物中的7种，包括3种脂肽（表面活性素，杆菌素D和丰霉素）（17），3种聚酮类化合物（大环内酯，杆菌素和艰难梭菌素）（19、20）和一种铁载体（杆菌素），是用4合成的。 =-磷酸泛肽基转移酶（Sfp）依赖性非核糖体机制（10）。杆菌素是通过不依赖Sfp的非核糖体途径产生的（21）。加工植物唑啉和淀粉环蛋白，并通过核糖体合成修饰的肽（22、23）。这10种化合物在FZB42的生物防治特性中起重要作用。杆菌霉素D和风霉素具有抗真菌活性，尤其是对丝状食道真菌具有抗真菌作用（17）。三种聚酮化合物，杆菌肽和淀粉环蛋白与抗菌作用有关（19-21、24）。 az唑具有杀线虫活性（22）。杆菌铁蛋白作为铁载体，通过竞争铁吸收来抑制病原体（10）。脂肽表面活性蛋白具有抗病毒和抗支原体活性，并在生物膜形成和根部定植中起关键作用（25）。

在本研究中，我们发现FZB42对F. graminearum菌株PH-1具有很强的拮抗活性。 使用FZB42的突变体，我们证明了细菌霉素D参与了这种拮抗作用。 杆菌肽D是脂肽iturin家族的成员，是与形成环结构的alpha;-氨基酸互连的七肽（17，26）。尽管芽孢杆菌产生的许多脂肽具有抗植物病原体的作用，但其作用机理仍知之甚少。 一般认为，脂肽可能在微生物的细胞膜上形成孔，导致细胞质泄漏。 在本研究中，为阐明细菌霉素D的抗真菌活性的机制，我们对细菌霉素D产生的作用进行了详细分析，因为该脂肽是解淀粉芽孢杆菌-芽孢杆菌-F.graminearum相互作用的主要因素。

图1 FZB42及其突变体（A）和次生代谢产物提取物（B）对禾谷镰孢PH-1的拮抗活性。 在材料和方法中描述了FZB42及其突变体。 对照，对照（LB培养基或甲醇）。

结果 解淀粉芽孢杆菌FZB42产生的对芽孢杆菌D的禾本科镰刀菌的拮抗活性。拮抗作用分析表明，FZB42及其次级代谢产物的粗提物均可以抑制禾谷镰刀菌的生长。为了鉴定抗禾本科镰刀菌的杀真菌剂，使用了相应的FZB42突变体。在FZB42中，Sfp蛋白4 =-磷酸泛肽亚基转移酶充当肽基载体蛋白，并且对于生产三个脂肽和三个聚酮是必不可少的（10、17）。当在检测中使用缺乏Sfp的突变体CH03时，该菌株及其次级代谢产物没有抗真菌活性（图1A和B）。该发现表明，通过Sfp依赖性途径产生的脂肽和聚酮参与了禾谷镰刀菌生长的抑制。因此，使用了更多的突变菌株。三种缺乏聚酮化合物的突变体，即CH06（缺乏杆菌素），CH07（缺乏大乳素）和CH08（缺乏艰难梭菌素），以及CH01（缺乏表面活性素），均显示出与野生型FZB42相似的抗真菌活性。 （图1A和B）。该发现表明这四种非核糖体合成的化合物没有抗真菌活性。这四个突变体的共同特征是它们均产生芽孢霉素D和丰霉素。当测试杆菌霉素缺乏D和丰霉素的双重突变体AK3时，抗真菌活性被消除。然而，可以生产两个脂肽的突变体AK1（表面活性素和丰霉素生产者）和AK2（表面活性素和杆菌霉素D产生者）具有与FZB42相似的抗真菌活性（图1A和B）。然后，我们测试了两个双重突变体CH02和AK1S。 CH02仅产生一种脂肽，细菌霉素D，而AK1S仅合成一种脂肽，风霉素。两种突变体均可以抑制禾谷镰刀菌的生长（图1A和B）。以前，据报道表面活性素没有抗真菌活性（7、17）。因此，结果表明，细菌霉素D和丰霉素都起着杀菌作用，并在体外抑制禾本科镰刀菌的生长，证实了尖孢镰刀菌（teleomorph：Ascomycota，Hypocreales，Nectriaceae）获得的较早发现。凤霉素是一种脂十肽，其侧链具有-羟基脂肪酸，并且与杆菌霉素D相比具有不同的结构（17），引起了更多关注（27、28）。因此，在这项研究中，我们集中于杆菌霉素D的作用机理，先前证明它是FZB42产生的主要抗真菌剂（17）。

图2来自解淀粉芽孢杆菌CH 2的杆菌霉素D的纯化和表征。 （A）使用反相HPLC从解淀粉芽孢杆菌CH 2中纯化芽孢霉素D。 （B）通过反相HPLC分离并收集五个级分（I至V），并用于分析拮抗活性。 将45％乙腈（体积/体积）用作对照（CK）。 （C）通过HPLC分析从峰I收集的杆菌霉素D的纯度。

为了鉴定细菌霉素D的作用机理，生长仅产生细菌霉素D的CH 2突变体，并将其用于纯化。高效液相色谱（HPLC）分析显示在21分钟至30分钟之间有五个峰（图2A）。从这五个峰中提取的物质均显示出对禾谷镰刀菌的抑制活性（图2B）。基质辅助激光解吸电离—飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析显示，这五个峰中的主要成分是杆菌素D。 m / z 1,059.6，C17杆菌霉素D在m / z 1,111.6处的离子峰[（M K）]，以及C14到C18 bacillomycin D在m / z 1,053.5，1,067.5处的离子峰[（M Na）]， 1,081.7、1,095.6和1,109.6（请参见补充材料中的图S1）。在所有这些分子中都包含相同离子的分子中，分子量存在14 Da的差异，这表明在细菌霉素D（CH2为14 Da）中存在不同长度的脂肪酸链。这些结果与以前的报告相同（17）。从峰I收集的杆菌霉素D的纯度被确定为96.6％（图2C），该纯度用于进一步研究。我们测试了一系列浓度，以确定纯化的芽孢杆菌霉素D对禾谷镰刀菌的50％有效浓度（EC50）。结果表明，抑制活性随纯化的杆菌霉素D浓度的增加而增加（图S2），EC50约为30mu;g/ ml。

图3杆菌霉素D对禾谷镰孢PH-1菌丝和分生孢子形态的影响。 （A）9 g / ml细菌霉素D对F形态的影响

用光学显微镜观察到的禾本科PH-1菌丝和分生孢子。 （B和C）30 g / ml细菌霉素D对禾谷镰孢PH-1的超微结构影响

通过扫描电子显微镜（B）和透射电子显微镜（C）确定12小时后。 CW，细胞壁； 胞质 pm，质膜；

S，隔垫。 在所有实验中，将6.67％（体积/体积）的甲醇用作对照（CK）。

细菌霉素D引起的禾本科镰刀菌菌丝和分生孢子的微观和超微结构变化。在较低的9 g / ml浓度下用细菌霉素D处理的真菌菌丝体和孢子的形态学变化通过显微镜观察清楚地揭示。未经处理的禾本科镰刀菌菌丝体的结构井井有条，而在存在细菌霉素D的情况下其结构似乎肿胀（图3A）。在处理过的菌丝的顶端和中央都观察到了这些肿胀的结构。在分生孢子中也发现了类似的现象（图3A）。未经处理的分生孢子发芽并看起来正常。用杆菌霉素D处理后，分生孢子的萌发受到抑制，所产生的分生孢子出现肿胀（图3A）。但是，随着细菌霉素D浓度的增加，这些肿胀的结构逐渐减少（图S3）。在进一步的实验中，使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜在较高的结构水平上检测由相对较高浓度的细菌霉素D（30 g / ml）引起的对禾谷镰刀菌的损害。

扫描电子显微镜的结果表明，未经处理的对照的禾本科镰刀菌菌丝和分生孢子孢子看起来规则，完整和丰满，有柱状的躯干，并且通常在外表面上呈多隔膜。从分生孢子产生的胚芽管是可见的（图3B）。暴露于芽孢杆菌D时，发现菌丝和分生孢子有大量外部破坏，例如形状不规则，细胞壁疏松，表面下陷和干sh（图3B）。该发现表明，由于用杆菌霉素D处理，细胞质从细胞中漏出。为了证实该观察结果，使用了透射电子显微镜。在不存在杆菌霉素D的情况下，菌丝和分生孢子显示出明显的细胞壁，完整的质膜和隔膜，以及均匀分布的，电极质的和清晰可见的细胞质（图3C）。相反，处理过的菌丝和分生孢子的细胞壁显示出不规则的结构，没有可辨别的层，厚度不均匀，甚至是间隙结构（图3C）。杆菌霉素D处理还导致胞质溶解并引起质膜碎裂。此外，对细胞壁和细胞膜的损伤最终导致细胞质的渗漏，如处理细胞相对于对照细胞的较高电子密度所表明的。

细菌霉素D引起的禾本科镰刀菌活性氧的积累和细胞死亡。高浓度的活性氧（ROS）对细胞有害并导致细胞死亡（29）。为了研究由于细菌霉素D处理而导致的禾谷镰刀菌细胞是否积累了ROS，使用了一种ROS检测试剂盒。与对照相比，处理过的禾谷镰孢菌丝的菌丝和分生孢子显示出更强的绿色荧光。特别是对于菌丝，几乎整个菌丝体都显示绿色荧光（图4A）。随后的流式细胞术测定证实，与对照组相比，处理过的分生孢子具有更强的荧光强度（图S4）。禾谷镰刀菌含有五种假定的细胞外ROS清除酶，即三种假定的过氧化氢酶（FGSG_02881，FGSG_06554和FGSG_06733）和两种假定的过氧化物酶（FGSG_02974和FGSG_12369）（30）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析的结果表明，用杆菌霉素D处理后，禾本科镰刀菌中的所有五个基因都被下调，尤其是两个过氧化氢酶（FGSG_02881和FGSG_06554）的基因（图4B）。

因此，为进一步检测是否发生细胞死亡，将荧光素双乙酸盐和碘化丙啶双荧光染色与相差显微镜和荧光显微镜相结合，用于分析活细胞和死细胞。荧光素二乙酸酯是一种酶活性探针，可被非特异性酯酶识别。一旦化合物进入活细胞，这种识别就会释放绿色荧光，因此该化合物可作为活细胞的指示剂。碘化丙啶对膜损伤发出红色荧光，并用作死亡细胞的指示剂。如图5所示，未经处理的菌丝和分生孢子几乎没有死细胞（红色荧光）。因此，可以容易地识别出其绿色荧光（活细胞）勾勒出的典型形状。相反，暴露于30mu;g/ ml细菌霉素D 12

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