蜜蜂研究所在蜂胶多酚类成分的提取鉴定方面取得新进展外文翻译资料

 2023-01-06 11:19:06

食品化学

蜜蜂研究所在蜂胶多酚类成分的提取鉴定方面取得新进展

抽象：本研究旨在从脱脂薏苡研究不同提取物的抗氧化活性性

seed meal (DASM) based on the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay, peroxyl radical

籽粕（DASM）基于氧自由基吸收能力（ORAC）法、过氧自由基

scavenging capacity (PSC) assay and cellular antioxidant activity (CAA) assay

清除能力（PSC）法和细胞抗氧化活性（CAA）的测定所有的分数,数，

n-butanol fraction exhibited the highest antioxidant activity, followed by crude acetone extract and

正丁醇部位表现出抗氧化活性最高，其次是粗丙酮提取物水性组分。三分的分数通过Sephadex LH-20柱层析得到的组分3具有最高的抗氧化活性和总酚含量。有一个强大的总酚含量与抗氧化活性正相关。基于高效液相色谱法分析分3部分，均是最丰富的酚酸阿魏酸在67.28毫克/克，而主要的黄酮类化合物是在41.11毫克/克的主要的个别化合物的的子分数3，香豆酸表现出最高的ORAC值，和槲皮素具有PSC值和CAA值最高。

  1. 简介

薏仁（薏苡仁薏苡L -马元Stapf）冰草作物我有长的被用于作为食品和对人类和传统中国医学。薏仁冰主要在中国和日本菜，在它是被A保健食品增补剂（李，林，城，蒋介石，amp;amp; Kuo，2008）。

许多最近的研究已经表明薏苡仁的消耗，有益于人体健康（高、金田，氨基酸，和miyai，1992；许，林，林，郭，amp;amp; 蒋，2003）。此外，薏仁提取物具有抗炎（长尾，大冢，Kohda，Sato和山崎，1985）, 低血糖（高桥、Konno，与hikino，1986）和抗肿瘤效果（常，黄，红，2003）。薏仁油是许多薏苡仁的重要组成部分作为一种抗肿瘤药物的健康效益。以前的研究已经表明，薏苡种子中提取的油能有效抑制肿瘤细胞生长，具有较高的效率和帮助防止化学治疗中白细胞减少（路，张，和张，1999）。从孤立的薏苡仁薏苡种子表现出抗肿瘤活性，对埃利希腹水肉瘤小鼠（tanimura，1961）。然而，大型石油开采从薏苡种子产生大量的副产物，脱脂薏苡仁粉（DASM），其中可能还包含相当大的促进健康的生物活性物质的量，如酚类化合物。到目前为止，很少有研究关注的潜在价值对均，而是通常被作为废物丢弃。酚醛化合物是高的植物次生代谢产物在植物中的抗氧化活性，因此可以使用作为评价抗氧化能力的主要决定因素食品（Chan，伊克巴尔，孔，和babji，2011）。在过去，一些研究已经确定在薏苡壳或薏仁酚类化合物糠。Kuo等人。（2002）确定了六种酚类化合物薏苡壳，包括丁香酸、阿魏酸、丁香脂素，4-ketopinoresinol松柏醇和，具有较强的自由自由基清除活性。十黄酮类化合物陈从薏苡分离的抗炎作用，中、蒋、林（2011）。以前进行的一项研究我们的实验发现，薏苡仁具有高水平的总酚类含量及抗氧化活性的显著性（王，陈，谢，居，刘，2013）。然而，酚类成分在薏苡仁是不明确的，并没有研究重点从薏苡仁分离或酚类抗氧剂的鉴定。薏仁油是许多薏苡仁的重要组成部分健康效益fiTS，已被用来作为一种抗肿瘤药物。以前的研究已经表明，薏苡种子中提取的油能抑制癌细胞的生长，具有很高的效率和效果fi帮助防止化学治疗中白细胞减少（路，张，和张，1999）。从孤立的薏苡仁薏苡种子表现出抗肿瘤活性，对埃利希腹水肉瘤本研究主要是为了探索潜在的均为抗氧化剂和功能性食ingredientsb分离酚类抗氧化剂以及源均进行这些酚类物质的识别和定量分析化合物。在这项研究中，一个多步分离过程已开发和执行之前确定的总数酚类含量及抗氧化活性。几种酚类化合物有较强的抗氧化活性，确定了高效液相色谱法––ESI-MS/MS提取分析。

2.材料与方法

2.1.化学品和试剂

folin–ciocalteu试剂、石油醚、乙醇、乙酸乙酯、乙酸，丙酮，碳酸钠，磷酸钾（naco3）monobasic（KH2PO4）和酸式磷酸钾（K2HPO4）是分析级and were purchased from国药化工试剂有限公司（上海）。2 -偶氮2 -脒基丙烷）二盐酸盐（aaph），抗坏血酸（VC）6 -羟基tetramethylchroman - 2 - 2 , 5 , 7 ,羧酸（Trolox的）butylated hydroxytoluene（BHT），70 -醋酸dichlorofluorescein（DCFH-DA），randomly methylated -环糊精（RMCD）绿原酸，儿茶素，P hydroxybenzoic酸，香草酸，对香豆酸、香兰素、阿魏酸、芦丁、槲皮素、山奈酚是purchased从sigma–aldrich公司（圣路易斯，MO，USA）。甲醇和乙腈是色谱级and是purchased从默克公司（达姆施塔特，Germany）。人肝癌HepG2细胞均购自北京翠竹生物科技有限公司（北京，中国）。3（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-二苯基溴化（MTT），

二甲基亚砜（DMSO），DMEM培养基–高血糖（DMEM）中，汉克平衡盐溶液（HBSS），胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素从培养生物技术公司购买（卡尔斯巴德，CA，USA）。

2.2.DASM的预备学院在这项研究中使用的薏苡种子均购自当地

农民种植贵州黑箍C. lachryma-jobi L. var.马元Stapf黔西南，贵州省，中国。五百克薏苡种子粉碎成粉通过一个60目筛，在旋风除尘器（天津泰斯特仪器有限公司，天津，中国）。研磨后，其种子面粉与1升的石油醚为30分钟，在在摇床室温（国华电器有限公司，常州，中国）。随后，混合物被过滤通过2号Whatman滤纸和残渣再摄取两次以下相同的程序。最后，得到的残渣（DASM）收集，干燥烘箱，在45℃3小时，以除去任何残留溶剂，并存储在20提取。

2.3.和分级均提取一种制备、分离提取和均流图

如图1所示均进行粗提取的根据我们实验室先前报告的程序（王等人，2013）有轻微的修改。二百克均配合80%冷丙酮在1:10然后以4000 rpm离心15分钟，上清液比率（G：毫升）30分钟得到粗丙酮提取物（CAE）。合物被拆除，其余的颗粒重新提取两次遵循相同的程序。的上清液合并，蒸发使用旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，上海，中国）在45冻干。

图1。制备和脱脂薏苡分馏过程提取（薏苡仁lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf）籽粕。CAE是分级如下（Chan，伊克巴尔，孔，大井，amp;amp;伊斯梅尔，2014）：在冷冻干燥的80%丙酮提取物（4克）蒸馏水（100毫升），搅拌2小时，然后按分区三次石油醚100毫升从CAE去除残留的油脂。水层进一步划分顺序三次与正丁醇（150毫升，2小时）。这两个分别离心，浓缩如上所述的冷冻干燥。高炉用凝胶过滤色谱法进一步分离如下：冷冻干燥的样品（500毫克）溶解在80%乙醇10毫升，然后装上Sephadex LH-20树脂填充柱（76 - 1.5厘米，通用医疗生物科学乌普萨拉，瑞典）。样品经80%乙醇洗脱在40毫升/小时的流速和滤液收集在10毫升使用馏分收集器等分（bsz-100馏分收集器，上海青浦沪西仪器厂，上海，中国）。这个在280 nm处的吸光度（hd-3紫外探测器、上海青浦湖西仪器厂，上海，中国）是用来分隔正丁醇部位。每个子部分的等分试样进行汇总，如上所述的浓缩和冷冻干燥。

2.4.总酚含量的测定（TPC）

所有提取和测定组分及组分使用福林–Folin-Ciocalteu比色法描述单身，奥托弗，和lamuela拉文托斯（1999）和改性通过红十字会，Sorrells，刘（2005）。简单地说，每一个样品溶解1毫在1毫升70%的甲醇和0.1毫升福林–酚反应试剂和1毫升7%的碳酸钠溶液。后90钟，所得到的溶液的吸光度测定在760 nm的spectramax M2e板室温读者（分子设备公司，三藩加利福尼亚，美国）。没食子酸作为标准，总酚含量为表示为毫克没食子酸当量（mg GAE/ g样品。

2.5.氧自由基吸收能力（ORAC）测定ORAC

根据黄的方法确定，欧，hampsch Woodill弗拉纳根，和之前的（2002），改性的由张、张、张、刘（2010）。馏分，分组分和化合物的准被溶解在80%乙醇和75毫米磷酸盐缓冲液（PH值7.4）稀释。测定在96孔板中进行（康宁科学，康宁，NY，USA）。每一个包含20个样本的稀释样品提取液、缓冲溶液（空白）或Trolox的标准（0，6.25，12.5、25和50 mol/L），以及将荧光素（终浓度200.96 LM），分别在37°C培养20分钟。孵育后，119毫米aaph LL 20被添加到每个。使用spectramax测定荧光强度免疫酶标仪在485 nm处的激发和发射538纳米的35个周期每5分钟的曲线下面积（AUC）是由SoftMax Pro软件计算（版本5.4.1），然后减去空白来获得的净面积。通过线性回归计算的总决赛ORAC值浓度（LM）和净AUC。ORAC值表示为1mol/L Trolox当量每克样品（1mol/L特/克）。抗坏血酸被用来比较所获得的结果。

2.6.的清除自由基能力的测定（PSC）

PSC法根据DOM的方法进行

刘（2005）。所有提取物，组分，分组分和化合物溶于12% RMCD准备在50%丙酮水。11我通过水解制备荧光染料2.48毫米DCFH-DA和1毫升1毫米KOH然后稀释总体积为8毫升用75毫米磷酸盐缓冲液（PH值为7.4）。PSC的测定反应混合物由100会稀释12%大鼠肥大细胞脱颗粒样品，100镑50镑DCFH，200毫米aaph。控制反应用12% RMCD。荧光是在485 nm和538 nm的发射与spectramax监测免疫酶标仪。计算结果为1mol/L Trolox当量每克样品（1mol/L TE／g）。结果用VC和BHT相比。

2. 7 细胞培养HepG2

细胞维持在DMEM（Dulbecco改良含10%胎牛血清的Eagle中-高葡萄糖（FBS），50单位/毫升青霉素和链霉素和50 lg／ml保持在37摄氏度5%二氧化碳培养箱（热科学罗克福德市，白细胞介素，美国）。生成的20–30 HepG2细胞系为实验用。

2.8 细胞毒性试验

采用MTT法进行细胞毒性试验所描述的余黄（2010）与轻微的修改。HepG2（6 104细胞/孔）细胞接种于96孔板在100个生长培养基中，培养5%个二氧化碳培养箱在37摄氏度为24小时的介质，然后被丢弃和100中含有不同浓度的样品添加到每一个好，并培养了额外的24小时，威尔斯没有样品的接收介质作为控制。细胞然后培养4小时后，在37摄氏度后，加入20MTT（5毫克/毫升）在每。然后被丢弃的介质150我的DMSO添加到每个。盘子是放置在一个表振荡器30分钟，和吸光度是在570 nm处的酶标仪测量。浓度的样品的吸光度下降超过10%时与对照组相比，被认为是细胞毒性（沃尔夫和刘，2007）。

2.9 细胞的抗氧化活性（CAA）在HepG2细胞

在100个生长介质中的96孔板。约24小时后播种，生长介质被删除和威尔斯100我用PBS洗一次。三威尔斯进行治疗1小时100含不同浓度的介质除了25流明检测样品（终浓度）。

在培养基中除去，600流明AAPH应用100将血瘀证和96孔板的细胞立即放置到一个spectramax M2e酶标仪37 C.在538纳米的发射测量的激发波长为485纳米每5分钟1小时，每个板块包括三对照和空白威尔斯；控制威尔斯包含采用DCFH-DA细胞AAPH和空白威尔斯包含细胞检测以及HBSS无氧化剂。的EC50值分别表示为平均plusmn;SD采用三从相同的实验得到的数据集。在每一个实验中，槲皮素被用来作为一个标准和对样品的细胞抗氧化活性进行了表达为槲皮素等值1mol/L（QE）每克样品。

2.10

分析使用安捷伦1100系列演出高效液相色谱法–质谱系统（Agilent Technologies，帕洛阿尔托，加利福尼亚，美国）配备一个四级泵和一个二极管阵列检测器（爸爸）。Dionex好120 C18（5流明，4.6毫米150毫米）柱保持在25摄氏度使用。CAE，BF和SF3被解散在甲醇中1毫克/毫升，并通过尼龙膜过滤一个0.22-lm孔径注射前。不同梯度程序其次为酚类化合物的分离。优化的梯度程序被确定为（一）0.1%水和（乙）甲醇中的乙酸。洗脱梯度主要内容如下：0分，0%分，30分，30%分，50分，40%；60分，45%分，80分，100%分，100分，0%分，110分，0%分。注射量为10，并建立了流量在0.3毫升/分钟。色谱记录在280纳米。色谱系统被连接到质谱仪配备ESI源负离子操作模式使用的毛细管电压为3.5千伏，这是控制通过化学工作站软件。干燥的气体是氮气在350 C的雾化气压力为9升/分钟的速率为30 psi。一个质量范围为100 - 1000米/ z被选中。全面扫描在全扫描中，最丰富的离子质谱扫描通过使用碰撞能量为1 V的毫秒探测器样品中存在的酚类化合物

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