PGC-1α和MRP1在铅诱导的睾丸支持细胞中线粒体毒性中的作用外文翻译资料

 2022-08-07 15:08:21

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PGC-1alpha;和MRP1在铅诱导的睾丸支持细胞中线粒体毒性中的作用

摘要：

铅诱导的对睾丸支持细胞中线粒体的毒性作用尚未得到很好的研究，其潜在的机制尚不清楚。在这里，我们报道了过氧化物酶体激活的潜在作用，乙酸铅诱导小鼠睾丸支持细胞TM4产生线粒体毒性时，受体-g共激活因子1alpha;（PGC-1alpha;）和多药耐药蛋白1（MRP1）激活。我们发现醋酸铅处理显着降低了PGC-1alpha;的表达水平，但增加了TM4细胞线粒体中MRP1的水平。为了确定PGC-1alpha;和MRP1在乙酸铅诱导的线粒体毒性中的作用，我们分别诱导了了PGC-1alpha;稳定的过表达和MRP1稳定的低表达TM4细胞。醋酸铅处理引起TM4细胞线粒体超微结构破坏，Alpha;TP合成减少，ROS水平增加和凋亡细胞死亡。相反，稳定地过表达PGC-1alpha;可以明显改善醋酸铅治疗引起的线粒体毒性和细胞凋亡。此外，还发现稳定地降低MRP1的水平可使TM4细胞线粒体铅积累增加4-6倍。总之，这项研究的发现表明，PGC-1alpha;和MRP1在保护TM4细胞免受铅诱导的线粒体毒性中起重要作用，从而更好地理解了铅诱导的线粒体毒性。

1.引言

铅（Pb）是一种普遍存在的环境毒物。 铅对男性生殖系统存在毒性作用，但确切的作用机制还没有得到很好的研究和了解。发育中的生殖细胞和支持细胞不仅是抵抗异种毒素的屏障，而且也是生精的能量和营养库。睾丸支持细胞功能异常可能是男性生殖疾病的初始过程。

线粒体是真核细胞中细胞代谢的能量中心，也是活性氧（ROS）的主要来源。在生产过程中不断产生少量的ROS氧化磷酸化，而过量的ROS会影响线粒体功能和行为，可能导致细胞的线粒体死亡。

过氧化物酶体增殖物激活受体gamma;(PPARgamma;)辅激活因子1a (PGC-1alpha;)是调节线粒体生物发生与能量代谢的转录调控因子之一。

。PGC-1alpha;的转录活性主要是通过与核受体和其他转录因子（如核呼吸因子1和2）整合而激活的，后者又调节呼吸链亚基和mtDNA编码蛋白的表达。最近的证据表明PGC-1alpha;也可以在线粒体中表达，并与其他条带蛋白整合以调节线粒体基因组。重要的是，PGC-1alpha;也正在通过增加几种ROS解毒酶的表达和/或促进线粒体能量代谢而成为ROS去除的调节剂。以前，有证据表明PGC-1alpha;可以通过共激活SIRT3的表达来抑制ROS的产生，sirtuin脱乙酰基酶家族成员，其定位于线粒体并在ROS解毒中起作用。据报道，铅暴露会导致氧化应激和超微结构的线粒体损害，例如线粒体肿胀和线粒体嵴的消失。基于这些数据，我们提出一个假设，即PGC-1alpha;可能通过激活睾丸支持细胞中的SIRT3调节氧化应激和线粒体损伤，从而对铅诱导的线粒体损伤具有保护作用。由于铅暴露可以剂量依赖的方式积累在睾丸支持细胞中，因此最近的研究对多药耐药蛋白1（MRP1）有了更深入的了解。MRP1是跨膜转运蛋白ATP结合盒超家族的成员，并且在调节包括异种生物的药物，有毒物质和重金属离子在内的底物的流出和流入中起着至关重要的作用。有趣的是，最近在MRP1中检测到了几个正常组织的线粒体，提示MRP1在维持线粒体功能中的潜在作用。 然而，还不清楚MRP1是否在预防铅诱导的线粒体毒性中起作用。

小鼠睾丸支持细胞TM4系（TM4）来源于正常11至13日龄BALB / c小鼠的未成熟睾丸，并根据其形态，激素反应性和类固醇的代谢而最初表征为支持细胞。因此，该细胞系被广泛用于研究支持细胞的潜在功能。 在本研究中，我们使用两种修饰的具有PGC-1alpha;稳定的过表达和MRP1稳定的修饰的TM4细胞系，研究了PGC-1alpha;和MRP1在乙酸铅诱导的线粒体毒性和凋亡性细胞死亡中的潜在作用。

2. 材料和方法

2.1 细胞培养和醋酸铅处理

睾丸小鼠睾丸Sertoli（TM4）细胞购自ATCC。 将细胞接种在DMEM / F12培养基（Thermo Scientific，MA，USA）中的培养皿中，该培养基中添加了5％马血清（Thermo Scientific，MA，HS），2.5％胎牛血清（Thermo Scientific，MA，FBS），1.5 mM L-谷氨酰胺，100 mg / ml链霉素和100 U / ml青霉素。 将细胞在含5％CO2的环境中于37°C孵育。将细胞孵育过夜，达到75％，然后将其置于含有乙酸铅梯度的新鲜培养基中放置24小时。 根据我们初步研究的细胞活力测定，乙酸铅的浓度范围为0至80 mu;M。 此外，为了估计时间效应，将细胞与乙酸铅孵育3、12、24和48小时。

2.2 TM4细胞系的产生

2.2.1 PGC-1alpha;过表达细胞系（PGC-1alpha;（ ）TM4）

使用标准PCR方法产生小鼠PGC-1alpha; cDNA（NM_008904）。 通过DNA测序证实PGC-1alpha; cDNA序列。 随后将这些cDNA在CMV启动子的控制下插入表达绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体中。 pGLV5-PGC-1alpha;和pGLV5-Blank（空载体）的质粒是通过从转化的大肠杆菌TOP10细胞中大规模分离质粒而产生的。 用转染的293 T细胞通过荧光显微镜确定病毒滴度。病毒滴度最终定义为1times;108 TU / ml。 通过转染和随后通过嘌呤霉素选择中的有限稀释度进行分离获得了过量表达PGC-1alpha;或空白的克隆细胞系。 在稳定的转基因克隆中，通过实时定量PCR和蛋白质印迹法确定PGC-1alpha;的表达水平。

2.2.2 MRP1降低表达细胞系（MRP1（-）TM4）

降低MRP1表达的转基因细胞系先前已在我们的实验室中产生

2.3 线粒体分离，细胞质和线粒体组分收集

按照制造商的说明，使用细胞线粒体分离试剂盒分离线粒体。 简而言之，将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，胰蛋白酶消化，离心后除去上清液。 将细胞沉淀在4℃下重悬于含有1mM PMSF的2ml线粒体裂解缓冲液中15分钟，然后用玻璃匀浆器匀浆。 将细胞在4°C下以600g离心10分钟，收集上清液，然后在4°C下以11000g离心10分钟。 再次收集含有细胞线粒体部分的沉淀，以检测铅含量和蛋白质。

2.4 细胞超微结构

将细胞（每孔1times;105个）孵育过夜，然后放入100 ml含有不同浓度乙酸铅的新鲜培养基中。 温育24小时后，刮取细胞，固定在磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH7.4）中的2.5％（v / v）戊二醛中，并嵌入Epon并切成薄片。 切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用日立透射电子显微镜检测。

2.5 细胞ATP测定

按照制造商的说明，通过ATP检测试剂盒检测了细胞中的ATP。 简而言之，将细胞在裂解缓冲液中裂解，并在12,000g低于4℃离心5分钟，使用酶标仪将上清液用于检测ATP水平。

2.6 琥珀酸脱氢酶（SDH）活性测定

SDH活性试剂盒按照制造商的说明检查了SDH的活性。 将细胞用盐水洗涤两次，并在300 g低于4℃离心10分钟。 将细胞沉淀在冰上的裂解缓冲液中匀浆以制备样品。 将样品与工作溶液充分混合，并通过icroplate读取器进行检测

2.7 ROS测定

使用ROS Fluorescent Probe-DHE测量细胞的ROS，然后将细胞与醋酸铅浓度梯度增加的培养基一起孵育。 在37℃下用PBS稍微洗涤细胞，然后与含有10mu;mol / L荧光探针DHE的游离血清培养基一起温育40分钟。 在37℃下用游离血清培养基将细胞洗涤两次，然后置于检测过程中以获得荧光值。 使用荧光酶标仪（485 nm）评估荧光值激发和590 nm发射）和流式细胞仪（561 nm激发和610 nm激发）。

2.8 细胞凋亡

用PE Annexin V ApoptosisDetectionKit I评估铅诱导的细胞凋亡。简单地，将细胞用预冷的PBS洗涤并重悬于结合缓冲液中。 将一百毫升混合物转移至5毫升试管中，并用5微升PE-Annexin V和5微升7-氨基-放线菌素D（7-AAD）染色。 将混合物在25℃下在暗室中孵育15分钟，然后与400微升结合缓冲液混合并在1小时内通过流式细胞术分析。

2.9 Caspase 9/3活性测定

将细胞温育过夜，并置于含有乙酸铅梯度的新鲜培养基中24小时。 根据制造商的协议收集细胞。 将细胞上清液与Ac-LEHD-pNA（对于caspase 9）或Ac-DEVD-pNA（对于caspase 3）混合。 将混合物在37°C温育1小时。 用酶标仪测定caspase9/3的活性。

2.10 铅含量测定

线粒体用PBS在37°C洗涤3次，并用0.1％Triton X-100溶液裂解，然后按照制造商的说明，通过BCA方法对100 ml裂解液进行总蛋白测定。将剩余的500 微升裂解液转移到2 ml（单位）聚乙烯试管中，与500 微升 65％硝酸混合，并在65°C消化过夜。 用石墨炉原子吸收光谱法对细胞中铅的含量进行定量，并用归一化法来测定总蛋白含量。 在样品测定中使用标准物质（GBW08619）作为质量控制。

2.11 MRP1介导的转运活性

先前的研究表明，钙黄绿素-AM流出测定可以检测到MRP1介导的转运活性。MRP1在线粒体中的运输活动使用本研究中的改良方法进行了测量。 将线粒体分别重悬于存储缓冲液中，与1 mu;M钙黄绿素-AM孵育30分钟，并使用荧光酶标仪（485 nm激发和530 nm激发）进行分析。

2.12 蛋白质印记

对于细胞蛋白提取物，将细胞用冰冷的PBS洗涤，并在350g下离心10分钟以除去上清液。将细胞沉淀重悬于含有RIPA，1 mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）和10％（v / v）磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中。将混合物在恒定搅拌下于振动器中于4℃保持10分钟，然后以17000g离心20分钟。通过移液器从上清液中获得细胞提取物。对于线粒体蛋白提取物，将线粒体级分在4°C下重悬于含有1mM PMSF的线粒体裂解缓冲液中15分钟，然后在4°C下以11000g离心10分钟。从上清液中获得线粒体蛋白提取物。用上样缓冲液变性后，通过电泳分离出蛋白质提取物（30–100 mu;g），并转移至硝酸纤维素膜上。封闭，然后在4℃下与一抗一起孵育过夜。一抗包括PGC-1alpha;，抗SIRT3，抗MRP1抗GRP-75和抗beta;肌动蛋白。暴露条带并在FluorChem 8900可视化系统上成像。

2.13 统计学分析(中文文章里一般表达是这样的吗)

所有定量数据至少代表一式三份进行的三个独立实验。 数据表示为均值SD，并通过统计产品和服务解决方案软件（SPSS17.0）进行分析。使用学生t检验比较两个独立组的统计分析。 使用单向方差分析分析多个（gt; 2组）独立组的数据，然后进行Student–Newman–Keuls比较，以评估组之间的差异。 P值小于0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 乙酸铅改变TM4细胞线粒体中PGC-1alpha;的表达

为了研究PGC-1alpha;在铅诱导的毒性中的潜在作用，我们首先检测了PGC-1alpha;在TM4细胞线粒体中的表达水平。 总细胞蛋白提取物中PGC-1alpha;的表达首先增加到最大值，然后随着铅浓度从0到80 mu;M的增加而降低。 相反，铅暴露以剂量依赖的方式降低线粒体提取物中PGC-1alpha;的表达。 这些数据表明PGC-1alpha;可能是TM4细胞中铅诱导毒性的潜在机制之一。

3.2 PGC-1alpha;的过表达减轻了线粒体的超微结构损伤

由于总蛋白和线粒体提取物中PGC-1alpha;的表达减少，我们改造了PGC-1alpha;过表达的TM4细胞系，以研究PGC-1alpha;在铅诱导的线粒体毒性中的作用。正常的TM4细胞具有许多球形或细长的线粒体，并带有紧凑的管状嵴。铅引起的线粒体呈椭圆形的形态变化，称为“肿胀”和稀疏的嵴。较高剂量的乙酸铅（80 mu;M）显着改变了线粒体的结构，减少了嵴裂。暴露于乙酸铅时，PGC-1alpha;（ ）TM4细胞的线粒体形态也略有变化。有趣的是，在较高剂量的醋酸铅（80mu;M）下，TM4细胞中的线粒体横截面积似乎比PGC-1alpha;（ ）TM4细胞中的大，这表明TM4细胞可能遭受了更严重的肿胀此外，PGC-1alpha;（ ）TM4细胞比TM4细胞具有更多的线粒体。这些数据表明，PGC-1alpha;的过表达可能通过防止线粒体肿胀和保留线粒体的数量来减弱对线粒体超微结构的损伤。

3.3 PGC-1alpha;过表达减轻铅诱导的线粒体功能障碍

检测细胞ATP水平，SDH活性和ROS生成，以评估响应醋酸铅的线粒体功能。 乙酸铅以剂量依赖的方式极大地降低了ATP的合成。与对照相比，80 mu;M乙酸铅降低了ATP的水平约35.4％（P lt;0.01）。 尽管铅暴露也以剂量依赖的方式降低了PGC-1alpha;（ ）TM4细胞中的ATP水平，但PGC-1alpha;（ ）TM4细胞中的ATP含量平均约为64.1％（范围从7.3％到141.3） ％）高于TM4。 在TM4和PGC-1alpha;（ ）TM4细胞中，SDH活性均呈剂量依赖性降低，但PGC-1alpha;（ ）TM4细胞的SDH活性比TM4细胞增加54.7-161.8％。

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