RP-HPLC法联合测定兽药注射液中马来酸氯苯那敏和泼尼松龙的稳定性外文翻译资料

 2022-08-08 09:49:06

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RP-HPLC法联合测定兽药注射液中马来酸氯苯那敏和泼尼松龙的稳定性

本工作描述了一种通过高效液相色谱（HPLC）结合UV-Vis检测同时测定注射样品中马来酸氯苯那敏（CHRM）和醋酸泼尼松龙（PRED）的简单，快速，灵敏，准确和精确的方法。使用恒溶剂模式及由乙腈和磷酸盐缓冲液（50：50，v / v，30°C）组成的流动相，调节至pH 3.0，完成色谱分离。在Thermo Hypersil ODS C18色谱柱（5mu;m，4.6times;250 mm）上使用的流速为1.0 mL/min，样品的进样量为20mu;L。CHRM和PRED的分析在254nm的波长下进行。分析的运行时间为12.5分钟，结果发现CHRM和PRED的保留时间分别为2.81和5.07分钟。校准图显示，对于CHRM，浓度范围为10–70mu;g/ mL，对于PRED，浓度范围为20–140mu;g/ mL，线性度的测定系数（R2）ge;0.9986。重复性和重现性（表示为RSD％）分别低于1.72和1.47％。所提出的HPLC方法证明了注射剂中CHRM和PRED的脱除，简便，快速，可产生101.6–102.3％的回收率，而从研究中的分析物中完全分离降解产物，证明了提出的高效液相色谱法的特异性。

关键字：抗组胺药，皮质类固醇，HPLC，验证，稳定性指示方法

  1. 介绍

马来酸氯苯那敏化学名称为3-（4-氯苯基）-N-N-二甲基-3-吡啶-2-丙基-1-胺，是一种抗组胺药，通常用于治疗普通感冒，发热，以及过敏性疾病，例如荨麻疹和鼻炎。CHRM是用于小动物兽医实践的最广泛使用的抗组胺药之一。 CHRM与麻醉药或氨茶碱联合治疗咳嗽和上呼吸道症状[1-3]。泼尼松龙，是一种皮质类固醇，在炎性条件下被广泛使用，并作为一种免疫抑制药物[4–5]。从文献调查中可以看出，可以使用不同的分析方法分别或单独或与其他药物固定剂量联合使用来评估醋酸泼尼松龙和马来酸氯苯那敏。PRED和CHRM的分析中与其他药物结合使用的方法有：胶束电动色谱法[6-7]，质谱法[8-9]，高效液相色谱法（HPLC）[10-12]，拉曼光谱法[13]和薄层色谱密度测定法[14]。据我们所知，尚未有通过二极管阵列检测器（HPLC-DAD）进行HPLC同时测定药物制剂中马来酸氯苯那敏和醋酸泼尼松龙含量的报道。由于HPLC–DAD具有许多优势，因此通常使用该方法，例如高灵敏度，快速分析和高选择性。根据国际协调会议（ICH）的要求，在方法开发过程中进行压力测试是开发策略的一部分。压力研究通常是在深度反应条件下而不是在加速条件下进行的，并提供了有关药物固有稳定性的信息。稳定性研究方法已扩展到固定剂量的药物-药物结合，以在存在降解产物的情况下精确，准确地估计药物[15-16]。为了开发表明稳定性的方法，使用强制降解的方法来证明其特异性。因此，应在进行稳定性研究之前先进行确定，以确保所开发的分析方法是指示稳定性的方法。因此，发展用于指示彼此分离和确定CHRM和PRED以及降解产物的稳定性指示反相（RP）-HPLC方法是一个挑战。因此，已经尝试开发一个精确的，线性，精确，重复能，可再现的，坚固，具体为HPLC和CHRM PRED的在它们的降解产物的存在的测定方法。

本研究工作的目的是开发一种简单，专一，精确和准确的新型稳定性指示液相色谱（HPLC）方法，用于同时测定兽用注射样品中的CHRM和PRED。根据ICH指南对开发的HPLC方法进行了验证[17]，并成功地用于确定固定剂量药物组合中的CHRM和PRED。结果表明，所开发的方法可用于质量控制和稳定性。

  1. 实验

2．1化学品和试剂

CHRM和PRED参考标准品来自Schazoo 制药实验室（巴基斯坦拉合尔）。磷酸氢二铵（（NH4）2HPO4），磷酸（H3PO485％）和氢氧化钠购自Sigma Aldrich（美国圣路易斯）。乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）为HPLC级，由Merck（Darmstadt，Germany）提供。使用Millipore（美国马萨诸塞州贝德福德）的Milli-Q系统获得在整个实验中使用的双蒸馏水。使用的其他化学药品和溶剂均为分析试剂级。从当地市场收集含有CHRM（4.0 mg / mL）和PRED（10.0 mg / mL）的注射液。

2.2色谱条件

对于HPLC分析，使用了具有LC210泵，PC220 UV / Vis检测器，LC250柱温箱，LC240真空脱气机和LC Win 1.0软件的PG LC200高性能液相色谱系统。在Thermo Hypersil ODS C18色谱柱（5mu;m，4.6times;250 mm）上实现了CHRM，PRED和降解产物的最佳分离。流动相由ACN和磷酸盐缓冲液组成，该缓冲液在pH 3.0时以50:50（v / v）的比例泵送，并通过稀NaOH（pH计，Orion 5 Star，Thermo Scientific，英国）进行调节。检测在柱温下进行。通过进样20mu;L样品在30°C下进样，而流速和波长分别设置为1.0 mL / min和254 nm。在注入液相色谱系统之前，所有溶液（包括标准液，样品和流动相）均通过0.45-mu;m尼龙滤膜（德国萨托里乌斯）进行过滤。使用LC Win 1.0软件进行峰积分和定量。

2.3标准溶液和样品溶液的制备。将准确称量的CHRM（20 mg）和PRED（50 mg）溶解在甲醇中，并稀释至100 mL的最终体积。用甲醇将上述制备的储备溶液的一部分（10.0 mL）稀释至100 mL，以制备最终浓度的标准溶液。20.0mu;g/ mL（CHRM）和50.0mu;g/ mL（PRED）。从包含CHRM和PRED的进样瓶中取少量样品溶液（5.0 mL）放入100 mL烧瓶中，将其溶于甲醇中，并用甲醇补足至刻度。通过将10 mL上述制备的样品溶液用甲醇稀释至100.0 mL达到终浓度20.0mu;g/ mL（CHRM）和50.0mu;g/ mL（PRED）。

2.4系统适用性测试

在3天中分别在HPLC上将CHRM（20mu;g/ mL）和PRED（50mu;g/ mL）的工作标准溶液注射6次，并按照美国药典（USP）中的说明进行色谱参数的符合性检查，包括保留时间时间（lt;2％相对标准偏差[RSD]），峰面积（lt;2％RSD），拖尾因子（lt;2），选择性因子（gt; 1），分辨率（gt; 2）和理论塔板数（gt; 1000）[18-19]。

2.5验证研究

根据ICH指南[20]在特异性，线性，准确性，精密度，检测限（LOD）和定量限（LOQ）方面进行了验证研究。

2.5.1线性度

对于基于LC的方法（HPLC），对于CHRM，线性动态范围选择为10–70mu;g/ mL，对于PRED，线性动态范围选择为20–140mu;g/ mL。通过绘制峰面积获得y = ax b形式的线性校准曲线（y）CHRM和PRED药物相对于7种浓度的CHRM和PRED的标称浓度（x）一式三份，而a是校准曲线的斜率，b是截距。证明线性回归方程，并列出必要的参数。线性回归的所得参数（包括基于斜率和截距的响应的标准偏差（SD））用于确定LOD和LOQ。 LOD和LOQ分别定义为3.3sigma;/ S和10sigma;/ S [11、21–25]，其中sigma;是标准偏差，S是回归线的斜率。

2.5.2准确度

通过将已知量的纯药物以剂量制剂中50％，100％和150％的分析物三倍加样到预先分析的进样中，确定方法的准确性。CHRM的最终终浓度分别为30.0、40.0和50.0mu;g/ mL，75、100.0和75mg / mL。获得125.0mu;g/ mL的PRED。

2.5.3精密度

测定了不同浓度下的精密度（对于CHRM为30.0、40.0和50.0mu;g/ mL，对于PRED为75、100.0和125.0mu;g/ mL），以平均回收率和％RSD表示。通过一天中的5次重复来评估日内精度（重复性），而连续3天确定日间精度（可重复性）。

2.6强制降解研究

通过拟议的HPLC方法在酸性，碱性，氧化，光解和热条件下进行强制降解研究，以表明所购产品的CHRM终浓度为20mu;g/mL，PRED终浓度为50mu;g/mL，是通过酸性，碱性，氧化，光解和热条件进行的。将储备溶液分别用HCl（0.1 M）和NaOH（0.1M）处理以进行酸性和碱性水解，使用H2O2（3.0％v / v）进行氧化应激（1 h，75 ％RH / 40°C）。将固体形式暴露于紫外线（254 nm）下6小时后进行光解应力。将固体形式在100°C的烘箱中放置6小时。在指定的时间后，将应力过的化合物溶解在甲醇中，然后使用流动相将10.0 mL的这些储备溶液稀释至100 mL。

3.结果与讨论

好的HPLC方法的主要目标是从活性药物成分（API）中分离出紧密洗脱的降解产物。在方法开发过程中，采用了不同的色谱条件，例如固定相和流动相组成，并通过降解样品进行了优化。

3.1色谱条件的优化

建立了同时测定液体剂型中CHRM和PRED的HPLC方法。为了获得目标化合物的足够的分离度，干扰物质（包括赋形剂和基质效应）的存在对于开发液相色谱（LC）方法至关重要。本方法基于一次优化一因素策略。第一步，在200-400 nm范围内获取UV吸收光谱，这两种分析物在254 nm处获得最大吸收。具有不同固定相的不同色谱柱，例如Thermo Hypersil ODS， C18 （250 times; 4.6 mm， 5 mu;m）， 金星 XBP C18 （250 times;4.6 mm，5mu;m）和PurospherW RP-18，C18（250times;4.6 mm，5mu;m）分离CHRM，PRED及其降解产物。使用Thermo Hypersil ODS C18（250times;4.6 mm，5mu;m）可以实现最佳分离目的，其优点是可以从其降解产物中分离出2种药物，并具有良好的保留时间。

已尝试使用两种有机溶剂（乙腈和甲醇）优化HPLC方法。最初选择乙腈是由于报道的洗脱强度更高[26]。使用了不同比例的水和乙腈，但是磷酸盐缓冲液的存在改善了组分的分离。研究了pH对组分分离的影响（pH范围为2.0至7.0）。观察到，通过pH的增加，CHRM的保留时间增加，而PRED的保留时间略有减少。同样，较高的pH值会导致峰形变形并降低灵敏度。因此，选择pH 3.0可获得最佳分离效果。实际上，磷酸（缓冲溶液）的存在会影响分析物上的电荷，并最终影响其保留时间。因此，优化pH和流动相中缓冲溶液的比例以实现最佳分离是必不可少的。使用低ACN和较高缓冲液浓度所观察到的，色谱图具有较宽的峰和较长的保留时间。随着ACN浓度的增加和缓冲液浓度的降低，分析时间缩短，并且峰尖且对称。最后，选择了由ACN和磷酸盐缓冲液组成的流动相，其比例为50:50（v / v），并且将pH值调整为3.0。为了获得最佳分离效果，柱温应保持在30°C，流速保持在1.0 mL / min。使用Thermo Hypersil ODS C18色谱柱（5mu;m，4.6times;250 mm）进行HPLC分析，在254 nm的检测波长下获得了锐利且对称的峰。空白对照溶液（偏亚硫酸氢钠，Tween-80）也用于HPLC中以评估任何干扰峰。通过注入完成的20mu;L的样品进行成分的检测。

HPLC对CHRM和PRED的保留时间分别为2.81和5.07 min，发现赋形剂的存在对两种药物的分离均没有影响。因此，该方法可用于测定其药物制剂中的CHRM和PRED。

3.2验证研究

系统适用性参数已针对色谱系统进行了评估，因为它们是色谱参数的一致性，可确保分析系统的适用性和性能。如上所定义的，满足了接受标准并且表明了用于评估CHRM和PRED的稳定性的分析方法的良好特异性。从最近的CHRM峰开始，PRED的分离度因子大于2，表明了有效分离度。在优化的色谱条件下，CHRM和PRED的分离具有良好的分离度，良好的峰形和合理的测试时间。根据信噪比确定CHRM和PRED的LOD和LOQ。通过建议的LC方法测得的CHRM的LOD和LOQ为0.012和0.037mu;g/ mL，而CHRM为0.112和0.037mu;g/ mL。PRED分别为0.374mu;g/ mL。

方法的准确性是通过在商业产品中掺入已知量的标准药物后评估回收率研究来确定的。通过提出的HPLC对CHRM和PRED的回收率在99.48-100.12％和99.83-100.22％之间，证明了该方法适合其预期应用的合理性。

根据重复性（日内）和重现性（

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