斑马鱼在肝脏研究中的吸引力:肝脏生长发育和再生的调节外文翻译资料

 2022-08-08 11:30:47

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斑马鱼在肝脏研究中的吸引力:肝脏生长发育和再生的调节

Andrew G Cox1and Wolfram Goessling1,2,3,4

肝脏是一个重要的器官，在新陈代谢、消化和营养储存中起着关键作用。目前，研究斑马鱼在肝脏发育和再生过程中调控肝脏生长的途径已成为研究的一个模型系统。与其他脊椎动物相比，斑马鱼具有独特的优势，包括细胞分辨率的体内成像和大规模化学和基因筛选的能力。在这里，我们综述了斑马鱼肝脏发育过程中调控肝脏生长的细胞和分子机制。我们还强调了新出现的证据，即在肝损伤后，发育通路被重新激活以促进再生。最后，我们讨论斑马鱼如何改变药物发现的努力，并在肝损伤的临床前模型中确定刺激肝生长和提供肝保护的药物，最终目标是确定治疗肝病的新治疗方法。

介绍

在过去的二十年中，斑马鱼已经成为研究脊椎动物肝脏发育的主要模型系统。斑马鱼作为一个模型系统的主要优点之一是透明胚胎在子宫外快速发育，使肝脏发育可以在细胞水平上成像。此外，斑马鱼交配产生大量胚胎(gt;200)，这有助于化学和基因筛选，以识别新的基因和小分子，调节肝脏的形成。最后，对斑马鱼的基因组进行了测序，结果显示70%的人类基因与斑马鱼的基因同源。因此，支持肝脏发育和疾病的基因和发育途径在脊椎动物中高度保守。因此，支持肝脏发育和疾病的基因和发育途径在脊椎动物中高度保守。总之，这些特征使斑马鱼在肝脏研究中处于一个独特的位置，填补了在培养细胞中还原机制研究和综合小鼠研究之间的空白，后者提供了与人类病理生理学更高程度的相关性(图1)。

人类的肝脏是唯一的实体器官再生的能力。肝脏再生的过程是多方面的，因为它需要一个包含多种细 的背景下，急性肝损伤需要快速的再生反应来避免急性肝衰竭，而慢性肝损伤通常与损害肝脏再生的不良瘢痕(纤维化)相关。尽管具有临床意义，但令人惊讶的是，对于调节肝脏再生的分子机制知之甚少。我们大部分关于肝脏再生的知识是从啮齿类动物的研究中获得的。然而，最近对斑马鱼的研究拓展了现代肝脏研究领域，斑马鱼的再生能力比哺乳动物强。这篇综述将强调斑马鱼作为一种互补模式生物的价值，并概述一些创新的方法，这些方法可以对肝脏再生的分子和细胞基础产生新的见解。

发育过程中肝脏生长的调节（斑马鱼肝脏发育简介）

Stainier和他的同事[3,4]利用转基因Tg(XIa.Eef1a1:GFP)(肠道:GFP)鱼类，这些鱼在整个内胚层都表达GFP，定义了斑马鱼肝脏发育的形态学阶段，包括第一阶段，肝脏规范，第二阶段，肝脏出芽，第三阶段，肝脏生长。24hpf时，内胚层棒前部腹表面的细胞开始表达成肝细胞标记物，如prox1和hhex。随后，特定的成肝细胞开始向胚胎左侧出芽，在36hpf时，原始肝芽和肠道之间的连接受到限制，因为细胞开始具有胆道性，最终形成总胆管。从48高通滤波器在当前肝脏发育的生长阶段，伴随着肝细胞分化,形成胆汁导管网络和肝脏的血管化,功能齐全的72高通滤波器。斑马鱼肝脏主要由肝细胞(Tg中标记的细胞(fabp10a:GFP))组成[5,6]，肝细胞承担肝脏的大部分功能，包括分泌胆汁和血清蛋白，血液解毒，血脂、葡萄糖和氨基酸的代谢调节等。非实质细胞如内皮细胞(Tg标记细胞(kdrl:GFP))[7,8]胆道上皮细胞(BECs) (Tg标记细胞(krt18:GFP)) [9,10]和肝星状细胞(HSCs) (Tg中标记的细胞(hand2:GFP)) [11,12]通过运输血液和胆汁促进肝功能，同时传递有丝分裂信号促进肝脏生长。总之，这些具有里程碑意义的研究证明了荧光转基因系在体内对涉及肝功能的细胞成像的能力。

调节肝脏特性的途径

在整个脊椎动物界，肝脏的规范高度保守。核受体肝细胞核因子(hnf1)和转录因子造血表达同源异体(hhex)都是成肝细胞特异性所必需的[13,14]。影响肝早期发育的其他因素包括GATA转录因子，特别是GATA 6，它是成肝细胞规范[15]所必需的。表观遗传调控也在肝细胞命运的规划中发挥关键作用，因为hdac1突变胚胎无法指定成肝细胞[16]。这些细胞自主因子共同规划了前肠内胚层细胞向肝细胞谱系的命运。

新出现的证据表明,中胚层衍生Wnt, FGF和Bmp配体hepatoblast规范中发挥着基础性的作用(图2),欧博Stainier和他的同事透露,wnt2bb (prt突变)对肝脏规范至关重要,第一次显示Wnt通路中发挥着关键作用在调节肝脏发展[17]。Wnt2bb在与发育中的内胚层相邻的侧板中胚层中表达，在肝规范中起诱导作用。随后的研究表明，wnt2bb的过表达通过作用于frizzled受体同源物5 (fzd5)[18]，增强了成肝细胞增殖并诱导肝肿大。Wnt2bb通过激活nav3a的表达来增强成肝细胞芽的形成，nav3a引导内胚层迁移离开肠道内胚层[19]。机制研究表明，在wnt2bb突变体胚胎[20]中，Sox32是最终形成肝脏所必需的。最近的研究表明，EpCam和hnf1ba等其他因素与wnt2bb基因相互作用，从而确定肝胰腺祖细胞[21,22]。最近，我们利用apc突变体和wnt8诱导的转基因斑马鱼发现，肝脏的形成需要Wnt通路的动态调节，在早期体细胞发生中Wnt活性受到抑制，随后在肝特异性[23]期Wnt信号升高。在体细胞发育中期wnt8的诱导负调控内胚层的形成，然而，在肝特异性过程中wnt8的激活导致肝肿大。最近的研究表明，wnt8以细胞自主的方式直接将非肝内胚层细胞转化为成肝细胞[24?]。根据这些研究，很明显Wnt通路是发育过程中肝脏分化和生长的主控调节因子。

Dong、Stainier及其同事的突破性研究表明，Fgf10在相邻间质中表达，并调控肝胰腺胆道形态发生和肝细胞分化[25]。在本研究中，作者发现fgf10a缺失的胚胎表现出扩大的胆道形成和增强的肝分化。后续研究表明，Fgf10a在胰腺芽中表达，负调控肝脏功能[26]。根据这个概念，复合fgf10?/?;fgf24?/?突变胚胎发育出在胰腺[27]附近形成的异位肝细胞。Fgf10b肝脏中表达及其损耗抑制肝脏形成暗示,154年的发展机制、模式和器官形成图1服从HTP化学和基因操作相关性增加人体病理生理学综合简化的当前观点在遗传学和开发的优势斑马鱼作为模型系统研究肝脏生理(改编自[97])。《遗传学与发育杂志》2015,32:153-161 www.sciencedirect.com在原肠形成过程中刺激FGF信号使sox32磷酸化和失活，从而损害内胚层规范[29]。然而，通过诱导显性负FGF受体1 (dnFGFR1)的表达来抑制FGF信号，已经证明了FGF对成肝细胞[15]的特异性至关重要。有趣的是，在肝发育的生长阶段[30]，FGF信号也需要细胞自主的肝生长。总的来说，这些研究表明FGF信号在调节肝脏功能方面发挥着复杂的作用，同时有助于形成有丝分裂因子的环境。一些研究表明，Bmp在发育中期过度表达会破坏内胚层的规范，并破坏内胚层的前后模式，从而导致器官侧位缺陷[29,31,32]。Bmp2b表达于侧板中胚层，并通过受体alk8向成肝细胞[33]传递信号。alk8突变体中Bmp信号转导降低可抑制肝脏发育，而bmp2b过表达可导致胰腺命运细胞向肝命运[33]转分化。利用显性负bmp受体1 (dnBmpr1a)诱导的转基因研究表明，bmp信号通路对成肝细胞的发育至关重要，而不是维持血脑屏障0。Bmp2b过表达可部分弥补FGF信号[15]的缺失。Peng和同事已经证明，在蛋白磷酸酶1、调控亚基12A (ppp1r12a或mypt1) mypt1突变胚胎中，bmp2b的异位表达挽救了肝脏发育，该突变胚胎在侧板中胚层形成[34]中表现出缺陷。这些研究强调了Bmp信号在器官侧位和肝脏特异性中的重要性。

调节胆道规范和扩张的途径

在肝脏形成过程中，转录程序指示双潜能肝母细胞分化为肝细胞或胆道上皮细胞(BECs)(图2)。Pack和同事的初步研究表征了斑马鱼的胆道发育，发现Notch信号在调节胆道命运[35]中起关键作用。除Notch外，功能缺失研究表明，包括hnf6在内的转录因子家族在胆道分化和形态发生中发挥着重要作用[36,37]。最近有研究证实，sox9b是肝胰导管系统的主调节因子[38,39]。这些研究表明，sox9b突变斑马鱼在胚胎发育过程中表现出胆道形态发育和胆管小管缺陷，成年后出现胆汁淤积和纤维化。这些研究定义了肝胆发育过程中编程BECs的核心转录网络(Notch、oncut和sox9b)。

解除对细胞增殖和存活的管制对肝脏生长的影响

在斑马鱼发育过程中，细胞生物学基本方面的遗传缺陷往往表现为特定细胞类型的存活率或增殖减少而无法茁壮成长。例如，分选nexon 7 (snx7)和annexin A4 (anxa4)对成肝细胞存活都是必需的[40,41]。同样，小核RNA (snRNA)转录复合物snap4c是BEC生存[42]所必需的。线粒体自平衡在维持肝细胞存活中起着重要作用，例如在线粒体运输缺陷(tom22)[43]、线粒体RNA解旋酶活性(supv3L1)[44]和线粒体抗氧化活性(trx2)[45]中观察到的斑马鱼胚胎的快速肝脏变性。一些斑马鱼突变体如def[46,47]、elys[48,49]、ssrp1a[50]和bms1l[51]由于核仁缺陷而表现出肝脏发育不全，核仁缺陷在复制应激或DNA损伤反应中达到高峰。在类似的研究中，Sadler和同事已经确定，uhrf1突变体在发育过程中由于DNA低甲基化而形成小尺寸肝脏，导致细胞周期阻滞和诱导凋亡[52-55]。肝细胞增殖需要几个在发育中的肝脏中高度富集的基因，如基质金属蛋白酶mmp23b[56]，以及分泌通路成分leg1[57,58]和sec13[59]。其他基因包括肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, alr)[60]、zfyve9a[61]和klf6[62]似乎在肝脏发育的生长阶段特异性地需要增殖。总之，这些研究开始确定在肝脏发育过程中生存和增殖所需的因素。

在肝脏发育过程中调节肝脏生长的小分子

研究斑马鱼肝脏形成的关键优势之一是胚胎在子宫外发育，这有利于化学筛选。我们对斑马鱼胚胎进行了化学筛选，发现了许多在发育过程中调节肝脏生长的小分子(图2)。在这些hits中，我们观察到小分子影响视黄酸(RA)、前列腺素(PGE2)和一氧化氮(NO)信号调节肝脏的形成。我们发现，RA受体(RAR)激动剂(如ATRA)在发育过程中增强了肝脏大小，而RA通路抑制剂DEAB损害了肝脏发育[32]。Negishi等人的相关研究表明，RA信号通过诱导wnt2bb正向调节肝脏发育[63]。我们的实验室已经发表了一系列的研究，揭示了PGE2信号在调节细胞命运和肝脏生长方面之前未被重视的作用[64? 65-67]。这些研究表明，PGE2暴露刺激Wnt信号以促进肝脏生长，而环氧化酶抑制则损害肝脏发育。这些发现建立在Jones及其同事之前的研究基础之上，该研究表明PGE2在apc缺乏的斑马鱼中调节bcatenin稳定性[68,69]。我们最近发现，最佳肝脏发育不需要信号。在机制层面上，NO并不是通过经典的cmp介导的血管舒张来调节肝脏生长，而是通过s -亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)调节的s -亚硝基硫醇(SNO)信号。最近，Yin和他的同事进行了一项创新的化学筛选，以识别调节肝星状细胞[11]数量的小分子。本研究发现，RA信号转导或抑制VEGF通路可减少星状细胞的数量，而RXR激动剂甲戊酸可增加星状细胞的形成。Farooq等人的早期研究发现，HDAC抑制剂丙戊酸通过抑制成肝细胞的特异性和分化而损害肝脏发育[71]。由于DNA低甲基化和干扰素g介导的炎症反应的刺激，胚胎期暴露于5-氮杂胞苷对胆道发育有有害影响[72,73]。最近使用mTORC抑制剂Torin1或雷帕霉素的研究揭示了mTOR信号在wnt介导的肝脏增生中的关键作用[74]。总之，这些研究表明小分子如何与遗传模型结合使用，以获得对肝脏发育方面的新见解。

斑马鱼肝损伤模型研究肝再生（成人肝脏生理学导论）

成年斑马鱼肝脏的解剖结构一直是最近几篇综述的焦点[75,76]。斑马鱼的肝脏是一个位于肠道前端的三叶结构。与其他脊椎动物相似，斑马鱼肝细胞排列成双层肝索，肝索被沿中央静脉呈放射状分布的肝窦分隔。斑马鱼肝细胞极化，基底膜与包围窦的内皮细胞相邻，顶端膜形成引流到胆管前叶细胞的小管，这与它们吸收和分泌的方向性一致。与哺乳动物不同，斑马鱼的肝脏并没有分成带有中央静脉和门脉三联的分带肝小叶。相反，细胞间胆道小管与胆道树相吻合，胆道树通过总肝管将胆汁输送到胆囊，最终到达肠道。

部分肝切除术后的肝再生

目前最完善的肝再生模型是部分肝切除术[2]模型。Sadler及其同事的创新研究表明，成年斑马鱼在三分之一部分肝切除术后肝脏再生[53,54]。在这个模型中，沿着鱼腹侧的下叶是通过手术切除的。与哺乳动物中观察到的代偿性增生不同，斑马鱼的肝脏再生涉及到原始小叶结构的恢复(图3)。通过测量下叶再生，作者表明uhrf1缺陷(uhrf1 /?)斑马鱼的肝脏再生受到损害。在平行研究中，我们使用三分之一部分肝切除术模型揭示Wnt通路在肝再生[23]中起关键作用。在这些研究中，apc /?突变体和热休克型Tg(hsp70:wnt8)转基因，而肝再生在热休克型Tg(hsp70:dnTCF)转基因中受阻。相应的肝部分切除实验显示Apc /minmice的再生能力较野生型提高，说明Wnt通路作为肝再生的主控调节因子在进化上发挥着保守作用。此外，我们最近发现PGE2通路在肝再生过程中影响Wnt活性[64 65]。基于涉及s -亚硝基硫醇信号在肝脏生长中的发育研究，我们最近研究了G

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