吲哚化合物MA-35在炎症诱导的结肠癌模型中可以减轻肿瘤发生外文翻译资料

 2022-08-08 14:27:33

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吲哚化合物MA-35在炎症诱导的结肠癌模型中可以减轻肿瘤发生

摘要

在炎症性肠病中，慢性炎症会导致结肠癌的发展，即结肠炎相关癌症。本病与肿瘤坏死因子-alpha; (tnf-alpha;)信号相关。此外，肠道纤维化是一种常见的临床并发症，由转化生长因子beta;1 (TGF-beta;1)促进。在我们之前的研究中，MA-35通过抑制tnf-alpha;和TGF-beta;1信号通路减轻了肾纤维化。本研究旨在通过AOM/DSS小鼠模型研究MA-35可能的抗肿瘤和抗纤维化作用。在AOM/DSS小鼠模型中，每天口服MA-35，持续70天。AOM/DSS组与AOMDSS MA-35组体重减轻无明显差异，但MA-35改善了疾病活动指数评分和生存率。MA-35阻断AOM/DSS诱导的贫血和结肠缩短。MA-35减少结肠肿瘤的宏观形成。在显微镜下观察，MA-35减少了异型增生区域的炎症和纤维化。此外，MA-35可显著降低结肠TNF-alpha; mRNA水平，降低结肠白细胞介素6、TGF-beta;1和纤维连接蛋白1 mRNA水平。这些结果表明，MA-35通过减少炎症和纤维化来抑制AOM/DSS诱导的癌变。

炎症性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，临床上以肠道炎症失调为特征。慢性炎症的一种严重的长期并发症是结肠癌的发展，称为结肠炎相关结肠直肠癌(CAC)，是导致死亡的主要原因1。UC增加CAC的累积风险高达18%，而CD在发病30年后达到8.3% 1 - 3。尽管IBD的确切病理机制仍有争议，但炎症是结肠最常见的潜在致癌物之一。潜在的炎症导致肿瘤的发生和癌症的发展4。最近的研究结果表明，炎症粘膜中受损的上皮细胞和活化的免疫细胞在炎症过程中有重要作用5 - 7。此外，最近的研究表明，炎症过程中的一个主要因素涉及核因子-kappa;B(NF-kappa;B)途径，即通过促炎细胞因子、肿瘤坏死因子(TNF-alpha;)、白细胞介素(IL)-1、IL-68-10激活的核因子-kappa;B(NF-kappa;B)。上皮细胞中持续的NF-kappa;B激活被认为有助于CAC11的发展。因此，早期干预强效抗炎药物可能是预防CAC的有效途径。

结肠遗传毒性致癌物偶氮氧甲烷(AOM)和结肠炎诱导剂葡聚糖硫酸钠(DSS)联合应用的CAC动物模型已被广泛应用于分析CAC12,13的发生和预防机制。所有接受该方案治疗的小鼠都在结肠远端至中端出现肿瘤。几个调查人员表明，几位研究人员证明，在同一动物模型中抑制TNF-alpha;可以预防CAC的发展14, 15。此外，TNF-alpha;缺陷小鼠比WT小鼠发生肿瘤更少16,17。因此，我们认为TNF-alpha;在CAC的发生发展中起着关键作用。此外，肠道纤维化在IBD患者中是一种常见且具有破坏性的结果，并与肠狭窄和狭窄引起的显著发病率和死亡率相关18 - 20。

线粒体酸35 (MA-35)， 5-(3,5-二甲氧基苄氧基)-3-吲哚乙酸(indole3-acetic acid, IAA)是一种植物生长素21的衍生物。IAA在小鼠的肝肾和肠道厌氧菌中合成。IAA调控植物生长发育，是植物生命周期和身体发育的重要组成部分。此外，IAA能促进小鼠和人成纤维细胞的生长24。我们最近发现，MA-35表现出通过抑制Ikappa;B激酶(IKK)磷酸化介导的抗TNF-alpha;活性，这减轻了小鼠肝和肾的炎症25。

此外，MA-35通过抑制Smad3磷酸化和降低Smad3驱动的纤维化基因表达，同时具有抗TGF -beta;1作用。TNF-alpha;和TGF-beta;1的双重阻断可减轻炎症和肾纤维化25。由于TNF-alpha;在CAC的发生发展中起关键作用，我们通过抑制TNF-alpha;信号通路检测了MA-35在AOM/DSS小鼠模型中的抗肿瘤作用。同时观察了MA-35通过抑制TGF-beta;1信号通路的抗纤维化作用。

结果

在AOM/DSS小鼠模型中，MA-35抑制药物诱导的结肠炎和结肠炎相关结肠癌(CAC)的进展。 建立CAC小鼠模型，先注射致癌物AOM，然后口服2.5%DSS，共3个周期。研究方案总结在图1a中。由于在我们之前的研究中，MA-35对小鼠的体重、肝脏重量、肝脏组织学、血清ALT、血清TNF-alpha;均无影响25，因此我们推测，单独使用MA-35对小鼠的影响可能可以忽略不计。我们没有单独评估MA-35治疗组。如图1b所示，与对照组相比，AOM/DSS处理的小鼠体重明显降低。AOM/DSS小鼠(AOM/DSS MA-35组)灌胃MA-35对最终体重无影响。但与AOM/DSS MA-35组相比，AOM/DSS组有体重下降的趋势(图1b)。实验过程中，AOM/DSS组有4只小鼠死亡，可能是由于DSS的毒性作用所致(图1d)。因此，由于AOM/DSS组存活小鼠数量有限，我们无法证明各组之间的体重差异有统计学意义。

接下来，我们通过顺序监测测量疾病活动指数(DAI)评分，如图1c所示。饮用DSS后，AOM组小鼠出现体重减轻、腹泻、血便等症状，与对照组相比，DAI评分升高。在此情况下，第2、8周AOM/DSS MA-35组DAI评分较AOM/DSS组显著降低(p lt; 0.05，图1c)。

我们也检测了这些模型的存活率。如图1d所示，与AOM/DSS组相比，AOM/DSS组的存活率降低，但AOM/DSS MA-35组的存活率显著提高(p = 0.03)。这些数据表明，在AOM/DSS结肠炎模型中，MA-35具有改善症状和延长寿命的有益作用。

接下来我们对该模型进行生化和组织学分析。表1为患者死亡时生化指标(Na、K、Cl、离子化钙(iCa)、总二氧化碳(tCO2)、血尿素氮(BUN)、红细胞压积(Ht)、血红蛋白(Hb)、天冬转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT))。数据中，AOM/DSS组Hb、Ht较对照组明显降低(p lt; 0.01，见表1、图1e)。在此情况下，AOM/DSS MA-35组Hb和Ht的药物诱导下降明显恢复(p lt; 0.05)。由于有报道称DSS导致胃肠道出血26，这些结果表明MA-35改善了实验性结肠炎的贫血。

为了证实这一点，我们接下来对结肠进行了宏观检查。在接受DSS的小鼠中，结肠长度的缩短是评估结肠炎症严重程度的一个标志12，27 - 29。图2a显示了结肠的代表性图像。与对照组相比，AOM/DSS组结肠长度明显减少。然而，MA-35消除了DSS诱导的结肠缩短(p lt; 0.05)(图2b)。

在该模型中，肿瘤发展在远端结肠已被报道12,13。图2c显示了一个具有代表性的图像。对照组无肿瘤区。在AOM/DSS组，49plusmn;7.7%的面积被肿瘤取代。在此条件下，与AOM/DSS组相比，AOM/DSS MA-35组的肿瘤面积百分比(%)明显降低(图2d)。此外，与AOM/DSS组相比，AOM/DSS MA-35组直径大于2mm的肿瘤数量也有所减少(图2e)。这些数据表明，MA-35可降低AOM/DSS治疗后的肿瘤发展。

接下来，我们用Hamp;E染色对远端结肠(图3a)和中结肠至近端结肠(图3b)进行了组织学分析。在AOM/DSS小鼠模型中，炎症和腺癌主要发生在远端结肠12、13、29、30。然后我们评估了远端结肠的炎症和异型性(图3a)。AOM/DSS治疗组和AOM/DSS MA-35组均以结肠远端腺癌为主(图3a)。在结肠远端癌区，AOM/DSS组与AOM/DSS MA-35组炎症细胞浸润及上皮异型性无差异(图3a)。

接下来我们检查了从中间结肠到近端结肠的切片。图3b显示了具有代表性的Hamp;E染色的结肠中部至近端图像。在这些切片中，与对照组相比，AOM/DSS组隐窝变形(图3b，箭头)和炎症细胞浸润(图3b，白线包围)明显。炎症评分(组织学评分)31、32也升高(图3c)。相比之下，AOM/DSS MA-35组的组织学评分明显降低(图3c)。此外，为了评估结肠中部至近端纤维化，马森三色染色也被采用。(图3 d, e)

图1所示。MA-35对AOM/DSS小鼠模型的影响。(一)实验设计。(b)与对照组相比，经AOM/DSS处理的小鼠体重下降显著。MA-35 (AOM/DSS MA-35组)对AOM/DSS组的体重减轻无显著影响。(c)第2周、第8周AOM/DSS MA-35组DAI评分较AOM/DSS组有所提高。(d) AOM/DSS MA-35组生存率高于AOM/DSS组(p = 0.03)。(e)与AOM/DSS组相比， AOM/DSS MA-35组Hb、Ht均恢复正常。数据以平均值plusmn;SEM表示。统计分析采用Tukey检验和Kaplan-Meier方法进行log-rank检验。与AOM/DSS组比较，#p lt; 0.05， ##p lt; 0.01， *p lt; 0.05， **p lt; 0.01。

AOM/DSS诱导结肠间质严重纤维化(图3d，箭头)。在此情况下，MA-35显著减少了AOM/DSS MA-35组马松三色阳性区域，表明MA-35不仅抑制了AOM/DSS诱导的炎症，也抑制了纤维化。为了阐明MA-35的抗炎和抗纤维化作用，研究了MA-35的炎症基因(肿瘤坏死因子-alpha; 、白细胞介素-6 (Il6)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP1/Ccl2)、分化簇68 (Cd68))和纤维化基因(转化生长因子-1 (Tgfb1))的mRNA表达水平。

表1。死亡时的生化参数。数据以平均值plusmn;SEM表示。采用Tukey检验进行统计分析。#与对照组相比p lt; 0.01， *与AOM/DSS组相比p lt; 0.05。##与对照组比较p lt; 0.01。*与AOM/DSS组比较p lt; 0.05。并且real-time RT-PCR检测近端结肠(图4a)、中结肠(图4b)和远端结肠(图4c)中的纤维连接蛋白1 (Fn1)。

在近端区域(图4a)， AOM/DSS组Tnfa和Il6表达水平明显高于对照组，提示药物性炎症，但该区域未见肉眼异常增生或肿瘤。其他细胞因子(Ccl2和Cd68)或纤维化基因(Tgfb1和Fn1)在AOM/DSS组与对照组相比没有改变。

接下来我们检查了中结肠的基因表达，显示出不同的窝型和厚度的异常增生33。与AOM/DSS MA-35组相比，AOM/DSS MA-35组Tnfa表达水平有更强的下降趋势，il - 6表达明显降低(图4b)。此外，与AOM/DSS组相比，Tgfb1和Fn1的表达水平显著降低。在结肠远端(图4c)，我们检查了AOM/DSS诱导的癌组织。在该区域，炎症基因和纤维化基因无显著差异(图4c)。这些数据表明，MA-35可能通过减少异常增生结肠纤维化后的炎症来抑制AOM/ DSS诱导的癌变。

MA-35通过抑制IKK磷酸化抑制TNF-alpha;通路，通过抑制Smad2/3磷酸化抑制TGF-beta;1通路。在炎症过程中，巨噬细胞释放的TNF-alpha;与其膜TNF受体结合，然后磷酸化Ikappa;B激酶(IKK)。这种磷酸化的IKK诱导核因子-kappa;B (NF-kappa;B) p65/p50抑制结合蛋白的降解，称为“Ikappa;B”，随后释放的NF-kappa;B p65/p50异源二聚体被转位到细胞核中。核NF-kappa;B p65易位调节各种促炎基因的表达，如TNF-alpha;，MCP-1和IL-634。TNF-alpha;的产生进一步诱导IKK/NF-kappa;B通路的激活并形成一个正反馈环35。在我们之前的研究中，我们报道了MA-35在人肝星状细胞系LX-2细胞和大鼠肾NRF-49F成纤维细胞中抑制TNF-alpha;/IKK信号和TGF-beta;1/Smad3信号25。因此，我们利用人结肠癌细胞系HT-29检测了MA-35对TNF-alpha;信号转导通路和TGF-beta;1通路的影响。如图5a所示，在结肠癌HT-29细胞系中，TNF-alpha;刺激5min后IKK磷酸化水平最大。在这些条件下，与对照组相比，MA-35显著降低了IKK磷酸化(图5b)。接下来，我们分析了作为p-IKK下游信号的NF-kappa;B p65和TNF-alpha;的表达。MA-35显著抑制NF-kappa;B p65(图5c)和TNF-alpha;的磷酸化(图5d)。同时检测了MA-35对TGF-beta;1信号通路的影响。TGF-beta;1激活的Smad3磷酸化(Ser423/425)加速了Smad2/3-Smad4异源三聚体复合物向细胞核的转运，并促进TGF-beta;1靶基因的转录36。我们检测了人结肠癌细胞系HT-29，其在TGF-beta;1刺激后显示Smad3磷酸化。结肠癌细胞系HT-29中，TGF-beta;1刺激120min后，Smad3的磷酸化水平显著升高(图6a)。在此条件下，TGF-beta;1显著诱导Smad3磷酸化，而这种上调的Smad3磷酸化被MA-35显著抑制(图6b)。此外，TGF-beta;1诱导的Smad2磷酸化被MA-35显著抑制，表明MA-35不仅抑制Smad3，也抑制Smad2(图6c)。进一步分析Fn1和TGF-beta;1作为p-Smad2/3下游信号的表达水平。因此，MA-35显著抑制Fn1和TGF-beta;1的表达(图6d)。这些数据进一步表明，MA-35分别通过IKK和Smad2/3通路抑制炎症和纤维化。

讨论

本研究表明，吲哚衍生物MA-35通过NF-kappa;B抑制TNF-alpha;通路和Smad2/3抑制TGF-beta;1通路，从而减轻AOM/DSS诱导的结肠炎症和纤维化，从而抑制AOM/ DSS诱导的癌变。NF-kappa;B是通过ik34的磷酸化激活的，此前有研究报道，双胍

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