热反应和蛋白酶-可分解干扰素-多肽共轭物通过时间空间程序两步释放动力学对于肿瘤的治疗外文翻译资料

 2022-08-08 15:21:13

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热反应和蛋白酶-可分解干扰素-多肽共轭物通过时间空间程序两步释放动力学对于肿瘤的治疗

摘要

与天然蛋白质相比，蛋白质-聚合物共轭物表现出了更好的药代动力学，但其生物活性和肿瘤穿透性的降低，导致抗肿瘤效果有限。为了解决这一难题，我们公布了一种有着体温反应性和基质金属蛋白酶（MMP）可分解性的alpha;干扰素（IFNalpha;）与弹性蛋白样多肽（ELP）共轭物的基因工程，并通过时空程序两步释放动力学用于肿瘤的治疗。值得注意的是，共轭物可以相分离，皮下注射后能形成一个仓储，实现1个月的零级释放动力学。此外，它可以选择性地被肿瘤中过表达的MMPs分解，从ELP中释放IFNalpha;，从而恢复IFNalpha;的生物活性。因此，与小鼠黑色素瘤和卵巢肿瘤两种模型中的游离IFNalpha;相比，它显著增强了在肿瘤中的积累、对肿瘤的渗透性和抗肿瘤的作用。这些发现可能提供了一种智能技术，即温度敏感性和蛋白酶可分解性蛋白聚合物共轭物通过时空程序两步释放动力学在肿瘤方向的治疗。

1. 导言

蛋白质疗法在治疗癌症、糖尿病、传染病和炎症性疾病等各种疾病方面越来越重要。[1,2] 然而，大多数蛋白质治疗药物的循环半衰期短，因为它们的肾清除速度快，稳定性差。[3,4] 因此，他们需要经常注射高剂量的药物，这不仅导致高 治疗成本和病人依从性差，而且治疗效果低和还有严重的副作用。抗蛋白聚合物的共轭物，通常为聚乙二醇（PEG），蛋白质形成蛋白质-聚合物共轭物是一种常用的延长蛋白质半衰期的方法。[5-10] 事实上，16种聚乙二醇化蛋白疗法已在世界上得到临床应用。[10] 然而，虽然PEG化可以明显提高蛋白质的药代动力学，但它大大降低了蛋白质的生物活性。[7,11] 例如，食品和药物管理局批准的PEG化alpha;干扰素（IFNalpha;）PEGASYS（49.5 h）的半衰期比其游离的IFNalpha;（0.8 h）半衰期长61.9倍，而PEGASYS的生物活性比游离的IFNalpha;的生物活性低51.3倍。[11] 另一方面，由蛋白质的聚合物共轭引起的尺寸增大会减小蛋白质的肿瘤渗透性。药物动力学的改善与生物活性和肿瘤渗透性的降低之间的折中限制了蛋白质-聚合物共轭物的抗肿瘤作用。

方案1. a) IFNalpha;-MMPS-ELP(V)的体温反应和MMP可分解蛋白-聚合物共轭物的基因工程，通过时空程序的两步释放动力学来改善肿瘤治疗。b) 共轭物皮下注射后可形成仓储，并持续一个月缓慢地从仓储释放进入循环系统。c) 释放出来的共轭物可以通过EPR效应进入肿瘤，然后在肿瘤中通过MMP-2分解成游离IFNalpha;和ELP(V)，从而增强肿瘤穿透力和抗肿瘤的疗效。

为了解决这一难题，我们将有刺激反应的功能引入蛋白质-聚合物共轭物，以设计体温反应和基质金属蛋白酶（MMP）可分解的蛋白质-聚合物共轭物通过时空程序两步释放动力学来增强肿瘤治疗。在验证这个概念的研究中，MMP底物 （MMPS）作为连接物，在基因上与IFNalpha;的C端和体温反应性弹性蛋白多肽（ELP（V））的N端融合形成体温反应和MMP可分解的IFNalpha;-MMPS-ELP（V）共轭物（方案1a）。IFNalpha;临床上用于治疗肝炎和癌症。其临床相关活性已被归因于其免疫刺激功能，尽管它最初被认为是通过激活癌细胞中的IFNalpha;受体信号来直接杀死癌细胞。[12] ELPs是一种可生物降解的有生物相容性和温敏性的生物聚合物，由Val-Pro-Gly-Xaa-Gly重复单元组成，其中Xaa是客体残留物。[13-15] ELPs越来越多地被用作小分子药物的载体，[15-20] 肽和蛋白质疗法，[21-26] 还有纳米粒子。[27,28] MMPs，如MMP-2和MMP-9在肿瘤中过度表达，降解细胞外基质，使癌细胞从原发肿瘤迁移形成转移。[29] 这种病理生理现象已被用于药物传递系统，以从肿瘤的载体中释放药物。[30-33] 基于这些原理，我们认为IFNalpha;-MMPS-ELP（V）共轭物由于相变温度的浓度依赖性，在皮下注射后相分离形成仓储并慢慢从仓储释放到循环系统中，从而显著地改善了药代动力学（方案1b）。此外，释放的共轭物将通过被增强的渗透性和保留效应（EPR）积累到肿瘤中。[34] 它将在肿瘤中被MMPs分解成游离IFNalpha;和ELP（V），不仅使IFNalpha;的生物活性恢复，而且增强了对肿瘤的穿透性和抗肿瘤效果（方案1c）。事实上，在小鼠黑色素瘤和卵巢肿瘤两种模型中，与游离IFNalpha;相比，共轭物表现出明显增高的肿瘤内积累、肿瘤穿透性和抗肿瘤效果以及显著增强的药代动力学。

2. 结果和讨论

2.1. 合成、理化和生物活性表征

在本研究中，对具有不同Tt值的两个IFNalpha;-MMPS-ELP共轭物IFNalpha;-MMPS-ELP（V）和IFNalpha;-MMPS-ELP（A）进行了基因工程设计（参见辅助信息）。同时，制备了具有不同Tt值的两个MMP不可解的IFNalpha;-ELP共轭物IFNalpha;-ELP(V)和IFNalpha;-ELP(A)作为对照。具体来说，MMPS的序列是Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly（PLGLAG）。ELP（A）和ELP（V）中的A和V是VPGXG重复单元中的X。每个ELP链的重复单元数为90。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对共轭物进行分析，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进一步证实其具有预期的分子量（图1a，b）。通过动态光散射（DLS）确定共轭物的水动力半径（Rh）约为11nm，比IFNalpha;（2.9nm）的半径大3.8倍（图1c）。共轭物的圆二色性（CD）光谱与IFNalpha;几乎相同（图S1，辅助信息），表明IFNalpha;与ELP共轭没有改变IFNalpha;的二级结构。通过浊度测量，研究了共轭物的热响应相变行为（图S2，辅助信息）。共轭物显示出具有浓度相关Tt的急剧相变（图1d，e）。当浓度高于1times;10-6 M时，IFNalpha;-MMPS-ELP（V）和IFNalpha;-ELP（V）的Tt值低于体温37°C。这些数据表明，IFNalpha;-MMPS-ELP(V)和IFNalpha;-ELP(V)在高浓度皮下注射后可原位形成仓储，然后再低浓度地从仓储缓慢释放进入循环系统。相反，即使浓度高于1000times;10-6 M，IFNalpha;-MMPS-ELP（A）和IFNalpha;-ELP（A）的Tt值也远高于体温，这表明它们皮下注射后不能在原位形成仓储。共轭物的抗增殖活性（半最大抑制浓度，IC50 ，IFNalpha;-MMPS-ELP（V）是55.3 pg mL-1，IFNalpha;-MMPS-ELP（A）是53.8 pg mL-1，IFNalpha;-ELP（V）是54.6 pg mL-1，IFNalpha;-ELP（A）是56.9 pg mL-1）几乎是一样的，IFNalpha;（IC50 = 20.2 pg mL-1）大约是它们的37%(图1f)，表明这些共轭物由于相同的ELP链长度而具有相同的抗增殖活性。

图1. IFNalpha;-MMPS-ELP(V)的体外表征。a) 纯化后的SDS-PAGE分析。轨迹1：IFNalpha;-MMPS-ELP(V)，轨迹2：IFNalpha;-MMPS-ELP(A)，轨迹3：IFNalpha;，轨迹4：标记物，轨迹5：IFNalpha;-ELP(A)，轨迹6：IFNalpha;-ELP(V)。b) MALDI-TOF-MS光谱。每个样品的理论质量如括号所示。c) DLS分析，其中Rh为水动力学半径。d) 在25times;10-6 M磷酸盐缓冲液（PBS）下的浊度（OD350）随温度的变化。e) Tt的浓度依赖性。f) Daudi B细胞的体外细胞毒性。g) 用MMP-2繁殖后的SDS-PAGE分析。轨迹1：ELP(V)（37kD），轨迹2和9：IFNalpha;（20kD），轨迹3：用MMP-2繁殖的IFNalpha;-MMPS-ELP(V)（MMP-2 62kD，ELP(V) 37kD，IFNalpha; 20kD），轨迹4：IFNalpha;-MMPS-ELP(V)（58kD），轨迹5：标记物，轨迹6：IFNalpha;-MMPS-ELP(A)（55kD），轨迹7：用MMP-2繁殖的IFNalpha;-MMPS-ELP(A)（MMP-2 62kD，ELP(A) 35kD，IFNalpha; 20kD），轨迹8：MMP-2（62kD），轨迹10：ELP(A)（35kD）。h) MMP-2处理后的Daudi B细胞体外细胞毒性。i) MMP-2处理后与IFNalpha;在相对抗增殖活性方面的对比。

2.2. IFNalpha;-MMPS-ELP在体外的MMP可分解性

为了研究IFNalpha;-MMPS-ELP（V）和IFNalpha;-MMPS-ELP（A）的MMP可分解性，用MMP-2处理共轭物，然后进行SDS-PAGE分析（图1g）。如预期所见，共轭物被分解为IFNalpha;和ELP两种，而IFNalpha;-ELP（V）和IFNalpha;-ELP（A）不能被MMP-2分解（图S3，辅助信息）。这些结果通过从卵巢肿瘤细胞和黑色素瘤细胞条件培养基培养出共轭物得到进一步证实（图S4，辅助信息），表明IFNalpha;-MMPS-ELP（V）和IFNalpha;-MMPS-ELP（A）可通过肿瘤细胞分泌的MMP分解成IFNalpha;和ELP。值得注意的是，在MMP-2处理后，IFNalpha;-MMPS-ELP（V）（21.8 pg mL-1，IC50）和IFNalpha;-MMPS-ELP（A）（22.1 pg mL-1，IC50）的抗增殖活性从IFNalpha;（20.2 pg mL-1，IC50）的37%增加到约91%（图1h，i），而IFNalpha;-ELP（A）和IFNalpha;-ELP（V）的生物活性并没有改变（图S5，信息支持）。这些数据表明，IFNalpha;-MMPS-ELP(V)和IFNalpha;-MMPS-ELP(A)可以被MMP-2分解，从ELP释放IFNalpha;，从而恢复高度生物活性。

2.3. IFNalpha;-MMPS-ELP（A）的MMP可分解功能对其体内特性的影响

我们进一步研究了C8161黑色素瘤小鼠模型中IFNalpha;-MMPS-ELP（A）的MMP可分解功能对其体内特性的影响（图2）。IFNalpha;-MMPS-ELP（A）的药代动力学与IFNalpha;-ELP（A）相似，但比游离IFNalpha;要好得多（图2a和表S1，辅助信息）。例如，IFNalpha;-MMPS-ELP(A)(8.9plusmn;1.0 h)和IFNalpha;-ELP(A)(9.6plusmn;2.7 h)的半衰期(t1/2)分别比游离IFNalpha;(1.4plusmn;0.21 h)的长6.4倍和6.9倍。IFNalpha;-MMPS-ELP(A)(684.1plusmn;12.1 micro;g L-1h)和IFNalpha;-ELP(A)(707.3plusmn;37.1 micro;g L-1h)的曲线下面积（AUCs）分别比游离IFNalpha;(61.8plusmn;1.7 micro;g L-1h)的大11.1和11.4倍。同样，IFNalpha;-MMPS-ELP(A)的生物分布几乎与IFNalpha;-ELP(A)相同，但远优于游离IFNalpha;的（图2b）。值得注意的是，IFNalpha;-MMPS-ELP（A）（每g组织117.7 ng IFNalpha;当量）和IFNalpha;-ELP（A）（每g组织120.8 ng IFNalpha;当量）的肿瘤浓度分别比游离IFNalpha;（3.6 ng g-1组织）的高32.7倍和33.6倍。这些数据表明，将MMPS连接剂引入IFNalpha;-ELP（A）并没有显著改变其药代动力学和生物分布。然而，与IFNalpha;-ELP(A)和游离IFNalpha;相比，IFNalpha;-MMPS-ELP(A)的肿瘤穿透力明显增强，如图所示在远离血管的区域（红色）IFNalpha;-MMPS-ELP（A）比起IFNalpha;-ELP（A）和游离IFNalpha;可以观察到更加强烈的荧光（黄色）（图2c和图S6，辅助信息）。这种现象可归因于肿瘤中过度表达的MMP-2将IFNalpha;-MMPS-ELP（A）分解为IFNalpha;和ELP（A）。因此，IFNalpha;-MMPS-ELP（A）比IFN

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