转录组分析证实金丝桃素的抗肿瘤机制 HOS胶质母细胞瘤细胞系的研究外文翻译资料

 2022-08-08 15:31:27

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转录组分析证实金丝桃素的抗肿瘤机制

HOS胶质母细胞瘤细胞系的研究

关键词：金丝桃素 HOS骨肉瘤系转录组分析 细胞凋亡

目的：贯叶连翘的金丝桃素对多种恶性细胞有细胞毒性作用，但介导这种作用的基因表达模式尚不清楚。在这里，我们试图分析HOS胶质母细胞瘤(GBM)细胞系对HYP的反应。

材料与方法：用HYP处理HOS骨肉瘤株。用MTT法和AnnexinV/PI法测定细胞毒性。通过高通量测序获得基因表达谱。对差异表达基因(DEGS)进行富集分析)。预测上游转录因子和调控DEGS的微RNA。计算DEGS对GBM患者生存的影响。进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，以获得关键的改变基因。评价HYP治疗对免疫应答的可能影响。

关键发现：HOS骨肉瘤株HYP的IC50测定为1.5mu;g/ml。细胞死亡的主要类型是凋亡。共发现312个DEGS。对受影响的基因本体术语和途径进行了鉴定。对DEGS上游调节剂的分析指出，转录因子与GBM干细胞转录因子显著重叠。生存分析表明，HYP最适合间充质亚型患者。肿瘤浸润分析预测HYP可能影响体内Treg和巨噬细胞浸润。利用GBM患者的表达模式和HYP诱导的DEGS，我们建议Fedratinib作为HYP的补充药物。

意义：我们的研究代表了HOS骨肉瘤系对HYP的反应，并根据GBM亚型对生存、转录因子和个性化进行了分析

导言

成人最常诊断的原发性脑癌是胶质母细胞瘤(GBM)。患者中位生存期为15个月左右，5年生存率低于5%. 尽管采取积极的治疗方案，即手术切除肿瘤，随后采用替莫唑胺(TMZ)进行放化疗双重治疗，但效果较差。.此外，GBM患者的复发率很高，部分原因是肿瘤的弥漫性和脑内肿瘤切除的限制。GBM的高复发率也可能部分归因于TMZ化疗对GBM stemness的影响。肿瘤的干性在一定程度上也是某些转录因子如SOX2、OCT4、NANOG、MYC和等作用的结果。不幸的是，前沿的GBM免疫治疗由于肿瘤的寒冷性而失败，增强肿瘤浸润的药物可能有助于对抗GBM;因此，对这种疾病似乎需要更有效的治疗。GBM治疗的另一个注意事项是缺乏基于疾病亚型的分层治疗。GBM肿瘤可分为间叶型、神经型、经典型和前神经型，但不影响处方用药的亚型相同。研究GBM肿瘤细胞系对药物的反应可以帮助寻找药物来逆转每个亚型的表达，或更有利地增加一个亚型的存活。金丝桃素(HYP)，一种来自H的活性化合物。穿孔，表现出促凋亡和抗血管生成的作用，因此它可能作为一种潜在的有效的抗肿瘤药物.事实上，HYP在针对复发的、渐进的GBM的I/II阶段临床试验中也显示了对GBM的承诺.值得注意的是，尽管微阵列表达谱显示了某些恶性肿瘤细胞株对金丝桃素的细胞反应目前，HYP对包括胶质母细胞瘤细胞系在内的脑癌细胞系转录组的影响尚未研究。此外，参考文献以HYP处理细胞为参考样本，测定HYP介导的光动力处理细胞中基因的表达，未报告HYP处理对未处理对照的影响。HOS骨肉瘤系是研究最多的GBM细胞系之一，其基因组已被测序为。本文报道了HYP对人脑胶质瘤HOS骨肉瘤系的细胞毒性及治疗后基因表达谱的变化。进一步的生物信息学分析阐明了该药物的抗肿瘤作用机制，并提出了与HYP联合使用可能有益的药物。

材料和方法

2.1. 材料和试剂

HYP、MTT检测试剂盒和胰蛋白酶均来自美国Sigma Aldrich公司。HOS骨肉瘤系购自伊朗巴斯德研究所。细胞在含10%胎牛血清、100mg /ml链霉素和100u /ml青霉素(均产自美国Gibco)的高糖杜氏修饰鹰培养液(DMEM)中培养。培养基每3天更新一次。膜联蛋白V/碘化丙啶(PI)试剂盒购自瑞士罗氏公司。RNA-seq在中国华大基因公司进行。

2.2.MTT法

采用MTT法测定金丝桃素对HOS骨肉瘤的致死剂量。HYP处理前24小时，96孔板每孔播散7000个细胞。然后，用不同浓度的HYP再处理培养的细胞24小时。HYP处理后，按照厂家的指示进行MTT检测。采用ELISA reader (BioTek ELX800微孔板reader;BioTek Instruments, Inc.，美国)在570 nm。为了进行统计分析，对零浓度进行了Dunnett多重比较事后检验的方差分析。

2.3. ros染色测金丝处理后细胞内活性氧

细胞用1.5mu;g/mlHYP处理24h。用TRIzol试剂(Invitrogen)提取RNA)。然后将样品送到BGI公司（中国），并使 IlluminaHiseq4000进行测序。通过快速QC和Trimmomatic对原始RNA-seq读取文件进行质量控制。干净的读数是由HiSAT2绘制的[15]反对人类参考基因组(V36)。袖扣工具包被用来检测基于Hi SAT2映射文件的差异表达基因(DEGS。

2.4.annexin v-PI双染测凋亡,dapi染色测凋亡

使用EnrichR网站进行了DEG的富集分析并使用ggplot2[18] R包可视化。 Cytoscape被用于检索、可视化和分析蛋白质-蛋白质相互作用。用cBioportalfor对GBM中枢纽基因的遗传改变进行分析。癌症基因组学(https://www.cbioportal.org/).为了GBM-基因TCGAGBM表达数据的亚型特异性表达是从cBioportal下载的，使用R版本3.6.2中的wilcox.test函数提取和分析有趣的基因。生存分析采用基因表达谱交互分析2(GEPIA2 http://gepia2.cancer-pku.cn/).采用Log-rank检验和Kaplan Meier分析来评估生存曲线之间的差异。利用肿瘤免疫估计资源服务器(Timer2)分析肿瘤浸润。http://timer.cistrome.org/).一般来说，逆转一种疾病的故障基因表达谱被认为是减轻疾病。为了获得可能补充HYP在将GBM表达谱恢复到正常组织中的作用的药物，我们首先获得了GBM间充质亚型中差异调控的基因。从Xena浏览器下载规范化TCGA GBM数据集。利用Deseq2 R包获取与正常样本相比在GBM间叶细胞亚型中的差异调控基因。将HYP处理HOS后发生相反变化方向的GBM中解除调控的基因排除在外，剩余的基因使用L1000CDs2服务器获得与HYP一起使用的潜在药物 。(http://amp.pharm.mssm.edu/L1000CDS2/).

结果

3.1.MTT法

对不同浓度HYP的HOS骨肉瘤的治疗表明，1.5mu;g/ml的金丝桃素可在24h内诱导50%的HOS骨肉瘤死亡.所有随后的测试都是在使用这种剂量的金丝桃素进行。

3.2.附件五/PI分析

为了研究细胞死亡的机制，采用AnnexinV/PI流式细胞术。结果表明，用IC50剂量的HYP治疗24h后，细胞发生凋亡.如图所示图 2这种治疗没有引起明显的坏死。

3.3.RNA测序和差异调控基因

总的来说，HiSAT2报告~控制和治疗样本的72%映射率。|log2FC的阈值gt;1和p值lt;0.01，从Cuffdiff输出中选择103个下调基因和209个上调基因。根据处理样品和未处理样品之间的log（折叠变化）和log10(p值)divide;值绘制基因的火山图(图 3).

3.4.基因集富集结果

上调基因富集于包括ecm受体相互作用和局灶性粘附在内的KEGG通路，下调基因富集于PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、细胞因子受体相互作用和膀胱癌等通路,在基因本体分析中，下调基因富集细胞增殖的正调控、对内质网应激的响应、细胞因子-细胞因子受体相互作用和生长因子活性，上调基因富集细胞外基质组织。

3.5.上游监管机构

为了检测DEGS的潜在调节剂，分析了靶向DEGS的微RNA和转录因子。费舍尔的精确测试被用来研究针对微RNA和转录因子靶点数据库的上调和下调基因，以找到在DEGS中具有过度表达靶点的调节剂。

对于miRNAs，我们发现17个下调基因被hsa-miR-124-3p(p值=0.0001，调整p值=0.456)靶向，15个上调基因被hsa-miR-26b-5p(p值=0.433，不显著)靶向)。

在差异调控基因中，CTCF、ATF3、WT1、MYC转录因子的靶点明显富集(图 5).

将差异调节转录因子(DETFs)和具有差异调节基因(EG-TFS)的转录因子(EG-TFS)与转录因子（转录因子）进行了比较，后者被报道为胶质瘤细胞的干细胞[4使用Fisher的精确测试(图 6).有趣的是，DETFs和EG-TFs都与GB M癌干细胞转录因子显著重叠。

3.6.利用TCGA数据进行生存分析

图7显示了由hyper诱导的DEGs的生存分析。值得注意的是，对于TCGA的每个亚型GBM数据，下调基因和上调基因分别进行分析。总生存期和无病生存期均显著改善间充质细胞瘤亚型的胶质母细胞瘤(无p值调整)。然而，这种影响在其他类型的胶质母细胞瘤中未见。

3.7.蛋白质-蛋白质相互作用网络

利用Cytoscape从STRING数据库中获得了鉴定为DEGS的基因的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。利用Cytoscape计算了PPI网络的度和中间度。集线器基因被定义为PPI网络中具有高程度的基因。巨型组件(134个节点和386个边缘，图 8网络被用来获得中间中心，这是衡量蛋白质在信号通路中的重要性的指标。其中FN1、BDNF、MYC、CTNNB1、IL8为前5位枢纽基因。

3.8.利用TCGA数据分析hub基因的表达和突变

细胞蛋白功能不平衡的来源不仅限于表达的解除管制，还包括突变。受HYP影响的基因的突变率决定了这种化合物在临床上的应用范围。从cBioPortal获得的集线器基因的复制显示在图 9在基因名称旁边列出的突变的累积百分比。在目前的TCGAGBM数据中，COL1A2基因的变异率最高（4%），BDNF、CXCL8、SORT1、RRP9、XBP1的变异率最低。作为参考，PTEN、TP53和EGFR基因在同一数据中的突变率分别为31.0%、29.0%和26.6%（数据未显示）。

为了检查在GBM数据中中枢基因是否通常一起改变，我们还使用cBioportal检查了GBM患者基因之间的互排性。当前版本TCGA的GBM数据未能检测到hub基因之间的显著正相关或负相关(数据未显示)。

3.9.中枢基因在正常肿瘤和原发肿瘤和复发肿瘤中的表达

为了检查HYP是否逆转GB M肿瘤基因向正常组织的表达，或通过将表达转移到复发肿瘤而加重基因表达的功能失调变化，比较了HYP处理细胞PPI相互作用网络在正常组织、原发性和复发性肿瘤中的枢纽基因的表达，并对TCGA数据进行了描述图 10以及使用HYP的基因的变化方向。

3.10.枢纽基因在不同GBM亚型中的表达

由于无病和总生存分析区分了间叶细胞亚型和其他亚型，我们还分析了不同亚型GBM之间hub基因的表达。其中，比较间充质亚型与其他亚型表达模式的差异。有趣的是，只有4/27个基因在间叶细胞和其他亚型之间没有差异调控，这表明GBM亚型对HYP的反应存在潜在的巨大差异。图11中还给出了HYP处理导致基因改变的方向，以供参考。

3.11. 在硅预测HYP治疗对肿瘤免疫的影响

富集结果:富集的KEGG信号通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用和tnf -信号通路;GO期细胞因子活性增强。这些结果表明羟脯氨酸治疗可能影响肿瘤-免疫相互作用。为了评估差异调节基因的潜在作用，计时器服务器被用来检查免疫细胞浸润对GBM肿瘤组织的影响。

研究了10个中枢基因、10个中心性最高和转录因子调控差异的基因。影响GBM肿瘤浸润的显著基因(p lt; 0.05)。如果一个基因被HYP处理上调，并且在TCGA GBM数据中其较高的值与较高的免疫浸润相关，或者当一个阻碍肿瘤浸润的基因被HYP处理下调时，该基因被认为是有利的。

3.12.潜在的药物组合

尽管在间叶细胞亚型GBM中下调基因的生存分析结果良好，但发现ecm受体相互作用和局灶性黏附通路在富集通路中;一些中枢基因的表达并没有向正常细胞类型恢复，而是向肿瘤复发的方向恢复。另一方面，两大富集mirna之一的miR-26b-5p可使GBM对TMZ化疗敏感。因此，为了进一步提高HYP的作用，我们也在寻找可能补充HYP对间叶细胞亚型基因改变作用的药物。使用L1000Cds2服务器，发现Fedratinib可以补充HYP在恢复GBM间叶细胞亚型中解除调控的基因表达方面的作用。

讨论

本实验研究了HYP对HOS骨肉瘤活力和基因表达谱的影响。经HYP处理的细胞在24 h时的IC50为1.5 mu;g/ml，与先前报道的HYP在其他细胞系中的IC50值一致;包括U-937细胞上0.2 mu;M, MCF-7和垂体腺瘤细胞系上5 mu;g/ml左右。HOS骨肉瘤对HYP的敏感性高于TMZ, TMZ的IC50值为330 mu;M。Annexin V/PI流式细胞术结果显示，在HYP IC50时，主要的细胞死亡机制是凋亡，而不是坏死。这与之前的研究结果一致，因为类似浓度的HYP在肿瘤细胞系中诱导凋亡，而在正常细胞中则没有。

下调基因富集于细胞增殖、膀胱癌、细胞因子-细胞因子受体相互作用和HIF-1信号通路的正向调控。HIF1有助于GBM细胞在缺氧环境中存活，并与GBM患者血管增生及肿瘤细胞的侵袭性有关，下调该通路降低了肿瘤细胞的侵袭性。此外，被下调基因的上游调制器如microRNAs和转录因子已被证明可以诱导抗癌症的良好结

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