杂化纳米晶体：实现同时治疗和实体肿瘤的生物成像功能外文翻译资料

 2022-08-07 14:21:41

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杂化纳米晶体：实现同时治疗和实体肿瘤的生物成像功能

赵荣生，dagger;Christin P. Hollis，dagger;Hua Hua，dagger;Lili Sun，dagger;Richard A. Gemeinhart，bull;和Tonglei Li *，dagger;

dagger;药物科学，肯塔基大学，列克星敦，肯塔基州40536，美国

Dagger;伊利诺伊大学芝加哥分校的生物制药科学，生物工程以及眼科学和视觉科学，美国伊利诺斯州60612

摘要:将杂交纳米晶体静脉注射给荷瘤小鼠后，生物显像剂和治疗剂在异位肿瘤中积累。固态纳米紫杉醇晶体在整个晶格中物理结合了荧光分子，并在固态下保持了荧光特性。杂化纳米晶体明显位于实体瘤中，并在肿瘤中保留数天。这些杂化纳米晶体有望产生抗癌效果。

关键词:纳米晶体，抗癌，生物成像，治疗学，紫杉醇

  • 引言

抗肿瘤化疗仍然是癌症治疗的基石。然而，向癌症患者输送化疗药物面临两大障碍。第一个障碍是抗癌化合物无处不在的细胞毒性，这种化合物也会损害健康细胞，对重要器官和免疫系统构成严重威胁。第二个障碍源于许多抗肿瘤药物的极低水溶性。药物输送的一种常见做法是在给药前采取明显的、表面上简单的途径来溶解药物，包括溶剂基、表面活性剂、聚合物或脂质包封系统。当这些设计还试图通过利用增强的渗透性和保持性(EPR)效应形成纳米尺寸颗粒来解决第一个障碍时，这样的设计变得过于复杂。电子顺磁共振是靶向癌症药物递送的标志，其中肿瘤块中的脉管系统比健康组织中的脉管系统“渗漏”得更多，允许循环药物载体进入肿瘤并由于肿瘤的淋巴系统发育不良而被困住。通常，这些方法限制了药物的装载，引起了对系统完整性和物理稳定性的关注，并最终呈现这些努力中许多都是徒劳的。。

药物纳米晶体的悬浮液最近被探索用于递送抗癌药物。一些产品已经进入临床试验和市场，为此付出了巨大的努力。以纳米晶体的形式直接给药溶解性差的药物可以避免增溶的需要，并避免后续的操作注意事项。纳米晶体的制备可以通过自上而下的方法(如研磨)或自下而上的控制晶体生长方法来完成。然而，安全整合功能性化学品似乎非常困难，比如生物显像剂，转化为药物纳米晶体，在体内不断溶解，尽管对于难溶性药物来说是缓慢的。

为了构建多组分、多功能的纳米晶体，我们求助于固态化学中一个众所周知的现象：客体包裹体。有人观察到，客体分子可以作为缺陷嵌入或生长到晶体主体的晶格中，客体的数量通常是微小的，这使得主体的特定性质发生重大变化，比如光学外观、机械耐久性和电子导电性。例子很多，包括天然的（如彩色钻石）和合成的（如合金和p型和n型半导体）。我们特别受到有机着色剂嵌入有机晶体的染色晶体研究的启发。因此，我们提供难溶性药物的想法的实质是将功能性客体物质整合到治疗性化合物的晶格中。通过在纳米晶体中产生这种混合系统，同时进行肿瘤靶向和成像成为可能。在此，我们报告了最近一项生长和测试集成荧光分子的紫杉醇纳米晶的研究。虽然荧光探针在临床医学上越来越受欢迎，荧光探针可能不适合所有人类成像应用。这项概念验证研究可能为临床应用（如放射性核素）合并其他类型的显像剂打开大门。

  • 实验阶段

材料。Paclitaxel（＞99.5%，USP30）购自21CePcARM（东萨塞克斯，英国）；FPR-79荧光团（最大激发波长，sum;Ex＝749 nm；最大发射，sum;EM＝782 nm）来自Akina（西拉法叶，In）；荧光素（sum;EX＝494 nm，sum;EM＝521 nm），Rhodamine B（alpha;EX＝530 nm，sum;EM＝590 nm）来自Sigma（St路易斯，Mo）。乙醇（HPLC级），乙腈（HPLC级），和二甲基亚砜（二甲亚砜，ACS级）购自Fisher科学（匹兹堡，PA）。所有的化学物质和溶剂在没有进一步纯化的情况下被利用。所有实验均采用去离子水（mili-Q，0.2mu;m膜过滤）。用于过滤的沃特曼核孔聚碳酸酯轨道蚀刻膜购自Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。

纳米晶体的制备。采用反溶剂法制备了纯紫杉醇纳米晶和杂化紫杉醇纳米晶。在一个典型的实验中，在20毫升去离子水中加入1毫升5毫克/毫升的乙醇紫杉醇。将混合物以1000转/分的速度搅拌，搅拌轴放在浸没在超声波浴中的圆底烧瓶中（F20D，Fisher Scientific）。随后调整搅拌速度，以尽量减少气泡的形成并促进均匀成核。结晶后，用50nm聚碳酸酯滤纸过滤溶液，并将保留物风干，再悬浮在水中，然后进行额外过滤-重悬浮循环。为了制备杂化纳米晶，除了在结晶过程之前将5mg/mL染料溶解在去离子水中外，使用了相同的方法。

图1.纳米沉淀过程形成晶体。 纳米晶体样品，紫杉醇（a），紫杉醇/ FPR-749杂合体（b），紫杉醇/荧光素（c）和紫杉醇/若丹明B（d）的扫描电子显微照片具有规则的针状形状。

纳米晶体分析。使用日立SEM 4300在3kv加速电压下获得SEM图像。在可视化之前，使用溅射涂布器，样品用金钯（Au/Pd）的导电层涂覆1分钟，电流为20毫安，导致大约15 nm厚的涂层。除SEM分析外，用Malvern-Zetasizer（Nano-ZS）测定了蒸馏去离子水中的粒径和zeta电位。作为结晶度的初步评估，在粉末X射线衍射仪（多重X射线衍射仪，Rigaku）上收集了Cu-KR辐射（40kv，44ma）的X射线功率衍射。扫描时间从5到40度°步长为0.04°扫描速度是0.5°/最小值。采用高压液相色谱法（HPLC，Waters Breeze）对紫杉醇进行了定量分析，色谱柱为水对称的C18-5mu;m柱（4.6times;150 mm）；用紫外检测器（Waters 2487双lambda;吸光度检测器）在227 nm处进行分析，流动相为乙醇/乙腈（50:50），以1.5 mL/min的速率泵送（Waters 1525双波长泵送）。荧光平板阅读器测定荧光团。在DMSO中制备了FR-749荧光粉的标准溶液，其浓度范围为39ng/mL～1.25mu;g/mL，用SpectraMax M5（分子器件）分别在766和799nm的激发和发射波长下测量。荧光素和罗丹明B的分析方法相似。

细胞培养。用10%胎牛血清（Hyclone）和1%青霉素/链霉素（Hyclone）培养MCF-7乳腺癌细胞。胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸，Mediatech）用于分离培养皿中的细胞。所有细胞培养试剂均购自Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。细胞培养在37℃在含5%二氧化碳的加湿空气中。

动物研究。这项研究是根据大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准的裸鼠使用方案进行的，目的是研究药物纳米晶的治疗效果和生物成像。雌性裸鼠（Tac:Cr:（NCr）-Foxn1-Nu）在3-4周龄（14.5-20克）。为了减少对动物的不适，所有建议的实验程序是在全麻下通过异氟醚吸入（约20秒）进行的。抵达后7天，在每只小鼠的耳间皮肤下，通过手术植入17beta;-雌二醇颗粒（1.7毫克，60天释放；创新研究公司）。随后，两天后，5times;10^6MCF-7细胞（100mu;L）用25-30号针。然后立即把老鼠送回它们的住处观察，直到它们有反应为止。每天监测动物的体重、身体状况评分（BCS）和一般肿瘤状况。任何垂死的动物都会被安乐死。一旦肿瘤可触及（即至少有200 mm3的肿瘤大小），小鼠被随机分配到治疗组或对照组。小鼠在尾静脉注射过程中受到抑制。除对照组外，每只小鼠注射20毫克/千克紫杉醇。对于盐水注射，总共注射100mu;L 0.9%氯化钠（灌溉，USP级，Aqualite系统，Hospira公司，Lake Forest，IL）。对于紫杉醇制剂，通过将300mu;Lo f3 0m g/m L紫杉醇在Cremophore EL/乙醇（50:50）溶液中与2700mu;L生理盐水（0.9%氯化钠）稀释制备3mg/mL紫杉醇。悬浮液在混合后立即注射到动物身上，以确保没有形成大的沉淀物。对于纯紫杉醇纳米晶和杂化紫杉醇纳米晶，通过过滤（50nm核孔滤光片）和超声在去离子水中再悬浮来浓缩纳米晶。该制剂的浓度约为3毫克/毫升。根据小鼠的体重，注射量变化，但不超过200mu;L，建议的最大注射量的小鼠。所有动物在治疗后7天用二氧化碳吸入法安乐死，然后颈椎脱位。

在活体成像中。活体光学成像是通过使用卡尺IVIS频谱获得的。用于显示FPR-749荧光团的激发波长和发射波长分别为740 nm和780 nm。在这些波长下，注射罗丹明B的小鼠表现出最小的背景荧光。以罗丹明B为显色剂，其激发波长和发射波长分别为535 nm和580 nm。为了进行比较，所有的成像参数，包括曝光时间、F-STOP(2)和入库(介质)，在整个7天的实验中都保持不变。

  • 结果和讨论

图2.紫杉醇纳米晶体的X射线衍射图。

图3.在紫外线下与荧光素混合的紫杉醇纳米晶体光。 后排（从左到右）：纯溶剂，0.015、0.028、0.022、0.25，混合纳米晶体和纯紫杉醇中的染料分别为0.83和0.86％纳米晶体。 前排（从左到右）：纯染料溶液的样品纯溶剂，4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031、0.008、0.002，0.0005mu;g/ mL。

制备了紫杉醇纯纳米晶和杂化紫杉醇纳米晶。几种染料物质被用作客体，包括荧光素、罗丹明B和FPR-749。根据扫描电镜图像(图1a-d)估算的紫杉醇纳米晶的平均尺寸分别为350nM和700nm.紫杉醇纳米晶的光散射结果为438.5 nm(8.3nm.)，多分散指数为0.242(0.007，与扫描电镜观察结果相一致)，紫杉醇纳米晶的平均粒径为350nM和700nm.光散射结果表明紫杉醇纳米晶的多分散性指数为0.242(0.007，与扫描电镜观察结果一致)。紫杉醇纳米晶(纯紫杉醇和杂化紫杉醇)的Zeta电位范围为-15to-22 mV。纳米晶样品在物理上是稳定的，在溶液中六个月没有看到颗粒大小或形状的剧烈变化(通过SEM验证)。这种稳定性可能是由于负表面电位所致，我们计划更详细地研究这些粒子的稳定性。虽然这些颗粒在水中作为单个颗粒在这段时间内是稳定的，但要了解这些颗粒在长期储存过程中的物理稳定性还需要进一步的研究。

制备的纳米颗粒规则的、细长的棱柱状形貌表明，在较大的微米级药物晶体上观察到了与形态相同的固体样品的结晶性质。此外，粉末X射线衍射图(图2)显示出结晶物质典型的锐利条带。紫杉醇纳米晶的衍射图与二水紫杉醇的衍射图相匹配。

对紫杉醇杂化纳米晶中染料分子的含量进行了光谱分析。测定了荧光素、罗丹明B和FPR-749的重量/重量比，结果分布广泛，制备的样品最高值分别为0.86%、1.26%和0.79%。注意，杂化纳米晶被过滤、漂洗、洗涤几次。悬浮循环，以最大限度地减少晶体表面的松散结合染料。为了确认生物成像能力，紫杉醇/荧光素杂化纳米晶分散在水中，并在紫外光(发射峰值在365 nm)下照射。杂化纳米晶样品清晰地显示出荧光发射(图3)。由于药物溶解度低(约0.2mu;g/mL)，当荧光素的包封率为0.86%时，估计释放到溶液中的游离荧光素分子少于0.002mu;g/mL(图3，后排，右二)。对于如此少量的染料，不能像纯染料溶液所显示的那样从自由溶解的染料分子中明显观察到荧光(图3，前排，右二)。因此，杂化纳米晶样品的荧光当然要归功于镶嵌在纳米晶体中的染料物质。有趣的是，当染料浓度降低时，杂化纳米晶的荧光发射明显地从绿色变为蓝色。相比之下，纯染料溶液的

颜色没有受到绿色的影响。晶体中的局部疏水环境似乎特别增强了荧光素的染料强度。

图4。MCF-7荷瘤小鼠的IVIS成像。肿瘤细胞从侧面开始，在明亮的视野中用红色箭头标记。荧光成像分别在780nm(激发、740nm)、相同曝光时间(0.25s)、F-stop(2)和binning(介质)的不同时间点进行。左侧给予单纯药物纳米晶;中部给予紫杉醇/FPR-749杂化纳米晶;右侧给予紫杉醇/罗丹明B纳米晶。高强度边缘是由于激励和发射滤光片的光干涉造成的。图像没有经过数字修改。

图5。如图4所示，3只小鼠分别在1(左)和24小时(右)接受了IVIS成像。荧光成像的激发波长为535 nm，发射波长为580nm。左侧给予纯药物纳米晶，中间给予杂交紫杉醇/FPR-749纳米晶;右侧给予紫杉醇/罗丹明B纳米晶。

将杂化纳米晶静脉注射给荷瘤小鼠，并在不同的时间点拍摄全身荧光图像(图4)。尾静脉注射后未见不良反应。给予含有FPR-749的混合纳米晶体的小鼠在780 nm的发射波长上清楚地显示出强烈的荧光，而两个对照组(图4中的左右两只小鼠)在该波长上没有明显的自发荧光。168h后，肿瘤部位仍可观察到荧光强度，有趣的是，在尾部还观察到一个高强度的斑点，这可能是由于局部积聚和/或血管外注射纳米晶体造成的。在注射部位之外，纳米晶体能够到达原发肿瘤部位并聚集。在4小时内，纳米晶体似乎已经到达肿瘤部位。罗丹明B被用作客体分子，进一步支持了纳米晶体在肿瘤中积累的概念，以及混合晶体技术不仅适用于一个荧光团的观点。不幸的是，在580 nm处有很强的自发荧光(图5)，使得药物/罗丹明B杂化纳米晶难以用于生物成像目的。尽管背景荧光很强，但很明显，杂化纳米晶体的强度最高，并且在肿瘤中有明显的(但不能量化的)积累。

图6.两只注射了FPR-749溶液（左）和紫杉醇/ FPR-749杂合纳米晶体（右）的MCF-7荷瘤小鼠的IVIS成像。所用的曝光时间为

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