半胱氨酰白三烯受体2参与大鼠局灶性脑缺血后神经元损伤，星形胶质细胞和小胶质增生及其时空特征

C. Z. ZHAO, B. ZHAO, X. Y. ZHANG, X. Q. HUANG, W. Z. SHI,

H. L. LIU, S. H. FANG, Y. B. LU, W. P. ZHANG, F. D. TANG AND

E. Q. WEI^*

摘要：缺血脑释放的强炎症介质半胱氨酰白三烯（CysLTs）可能通过激活CysLT₁受体和CysLT₂受体调节缺血性损伤。CysLT₁受体与缺血性损伤和缺血后修复密切相关；但是，CysLT₂受体介导的反应仍然未知。这里，我们研究大鼠局灶性脑缺血后脑组织CysLT₂受体表达和定位的空间的时空特点。正常情况下，CysLT₂受体仅分布于皮层和脑室周围的星形胶质细胞。局灶性脑缺血后，CysLT₂受体在神经元和胶质细胞的表达均发生上调。在急性期（6-24小时），缺血核心区CysLT₂受体表达上调主要在损伤的神经元；而在晚期阶段（3-28天），CysLT₂受体表达上调发生在缺血性核心区增生的小胶质细胞、边界区肥大的星形胶质细胞。因此，CysLT₂受体表达的时间与空间分布特点表明其在急性神经元损伤、晚期的星形细胞增多症和微小胶质细胞增生阶段中起调节作用。

关键词：局灶性脑缺血；半胱氨酰白三烯受体；神经元；星形胶质细胞；小胶质细胞

脑缺血会引发一系列复杂的高度相互连接的细胞和分子事件。在急性期（分钟至小时），由于能量衰竭，离子失衡，兴奋性毒性和氧化应激，最终导致缺血区核心中的神经元损伤，而晚期（小时至月或亚急性/慢性），复杂的炎症反应参与了细胞死亡和修复过程^[9,20,38,5]。在这些变化中，炎症是缺血后最重要的事件之一，小胶质细胞则是最重要的炎症调节剂^[20,38]。在缺血性损伤的晚期，缺血性核心边界区的反应性星形细胞增多，形成胶质瘢痕，可以发挥双重影响^[32,36]这些反应由许多生物分子参与，其中半胱氨酰白三烯（有效的炎症介质）起重要作用。

半胱氨酰白三烯（CysLTs，即LTC₄，LTD₄和LTE₄）是花生四烯酸的5-脂氧合酶代谢物，并且涉及许多炎性疾病，包括脑缺血^[4,46,6]。CysLTs的作用由G蛋白偶联受体CysLT₁和CysLT₂调控^[4,6,35]。这些受体介导外周器官中的各种反应，包括血管和平滑肌反应，免疫应答，炎症和组织修复^[19]；然而，他们在中枢神经系统病理生理学中的作用认识仍然有限。

在大鼠脑中，局灶性脑缺血后3-24小时和7天，CysLTs的内源性配体CysLT受体的产生增强，出现两个峰值^[46]。同时，在大鼠局灶性脑缺血后7-14天的边界区，CysLT₁受体的mRNA表达在3-12小时和7-14天在缺血核心中上调^[10]。上调的CysLT₁受体主要定位于24小时内的神经元和局部缺血后14天的巨噬细胞、小胶质细胞的缺血中心；而在边界区域缺血后14天，它们位于增殖的星形胶质细胞中^[10]。此外，CysLT₁受体拮抗剂减弱缺血性脑损伤^[44]，以及神经功能缺损，神经元损失，血脑屏障破坏，白细胞浸润和胶质瘢痕形成的后遗症^{[44,42,7,10,45]}。这些发现表明CysLTs参与急性脑损伤以及亚急性/慢性星形胶质细胞和小胶质细胞增生，这可能是部分通过CysLT₁受体介导的。此外，在6-24小时的缺血中心和3-14天的边界区域CysLT₂受体mRNA的表达上调^[10]。然而，上调CysLT₂受体的定位尚未确定，因为缺乏的特异性抗体，其作用在急性和迟发性局灶性脑缺血后需要研究。

CysLT₂受体mRNA在心脏、肾上腺、胎盘、脾脏和外周血白细胞中高度表达，在脑中相对较弱，下丘脑、丘脑、壳核、垂体和髓质均有表达^[12]。在外周系统中，CysLT₂受体在各种病理生理过程中发挥作用。CysLT₂受体已被证明介导内皮细胞^{[14,39,18,26]}和肥大细胞^[18]的反应，参与博来霉素诱导的肺纤维化^[3]，并在结直肠癌^[23,25]和乳腺癌^[24]预后良好。这些发现表明CysLT₂受体是炎症相关疾病中重要的调节分子。此外，报道称CysLT₂受体介导PC12 细胞^[33]和星形胶质细胞^[13,31]缺血性损伤，并对LTD₄诱导的星形胶质细胞中与缺血性损伤相关的蛋白AQP4 ^[31]表达上调 ^[37]。然而，CysLT₂受体是否参与缺血后神经元损伤、星形细胞和小胶质细胞增多仍不清楚。

基于这些研究结果，我们假设CysLT₂受体可能参与急性神经元损伤以及局灶性脑缺血晚期的星形胶质细胞和小胶质细胞增生。为了检验这个假设，我们确定了大鼠大脑中动脉闭塞模型中CysLT₂受体蛋白在脑中表达定位的时间和空间分布。

实验步骤

局灶性脑缺血

体重180-250克的雄性Sprague–Dawley大鼠，来自中国浙江省杭州医学科学院（证书编号:2008001603021）。在实验前将大鼠饲养在受控温度（22plusmn;1℃）和12小时明暗周期（从18:00至06:00关闭），自由进食和饮水，离开大鼠并让其适应生态房7天。

大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉（400 mg/kg）。聚乙烯管插入右股动脉使用计算机辅助系统连续监测血压（PC实验室，科龙公司，南京，中国），以及测量PaO₂、PaCO₂，动脉血pH值（ABL 330血气分析仪，博尚公司，丹麦）。血糖监测采用单触式血糖监测系统（LifeScan公司，美国）。局部脑血流（rCBF）及其他生理参数，如前所述^[39]使用激光多普勒流量计进行记录（ML191, AD Instruments Pty. Ltd.）。rCBF值缺血的稳态基线定义为 100%。在手术过程中用加热垫和加热灯测量直肠（核心）温度并保持在37.0plusmn;0.5 ℃。

如先前描述的那样进行短暂性脑缺血^[10,46]。麻醉后，颈正中切口，右侧颈外动脉和颈内动脉仔细暴露，并将一个3-0单丝尼龙线从颈外动脉插入颈内动脉闭塞大脑中动脉的起源。闭塞三十分钟后，取出缝线以允许再灌注。假手术大鼠进行同样的手术。

手术后，将动物放在温箱中约2小时维持体温。涉及动物及其护理的程序是按照国家卫生研究院的实验室动物护理和使用指南进行的。实验方案由浙江大学医学院实验动物护理与福利伦理委员会批准。

行为评估和组织学分析

脑缺血后6，12，24小时，与3，7，14和28天对神经功能缺损评分，根据所述方法^[2]，如下：0，没有缺损；1，当抓住尾巴抬起整个动物时，对侧前肢的屈曲；2，对外侧平面推力下降；3，向对侧旋转。经神经系统检查后，用 0.01 M PBS预清洗后，并用4%多聚甲醛经心脏灌注将大鼠麻醉。取出脑，并在30%蔗糖的溶液中孵育7天。此后，在冷冻切片机冰冻冠状切片 10或 20微米的厚度（CM1900，Leica，德国）。20 微米切片用 1%甲苯胺蓝染色进行组织学检查，计算梗死体积^[42,10]。

蛋白质印迹分析

在神经系统检查后的每个时间点，从缺血核心，边界区域和对侧皮层获取皮层组织。用含有（以mM计）胃蛋白酶抑制剂1，亮肽素2，苯基甲基磺酰氟1，抑肽酶80（康城生物技术公司，中国上海）pH 7.5的组织匀浆用放射性免疫沉淀法（RIPA）测定。匀浆在4℃下以12000转离心30分钟将蛋白质样品（60 mu;g）装载在10% SDS-PAGE上并印迹到硝酸纤维素膜（英杰公司）上。然后用兔多克隆抗CysLT₂受体抗体孵育（1:200；医学院，浙江大学，杭州，中国）如前所述的准备（张等，2009），或小鼠单克隆抗GAPDH抗体（1:5000，康成生物技术有限公司，上海，中国）过夜，然后加入抗兔IRDye700DX^reg;偶联抗体或抗小鼠IRDye800dx^reg;共轭抗体（1:5000，罗克兰）。特异性信号由Odyssey红外成像系统（LI-COR，Bioscience Lincoln，USA）检测。通过使用Quantity One^reg;分析软件（Bio-Rad Laboratories，CA，USA）的光密度测定法对蛋白质条带进行定量评估。

免疫组织化学和荧光显微镜

CysLT₂受体的表达在10微米冰冻切片证实。神经元用小鼠单克隆抗神经元核抗原（NeuN）抗体（1:200，Chemicon）进行免疫染色。通过与小鼠单克隆抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（1:600，Chemicon）和兔多克隆抗离子钙结合适配器分子1（Iba1）抗体（1:1000，Wako）共同检测来检测星形胶质细胞和小胶质细胞。将切片用兔多克隆抗CysLT₂受体抗体（1:1000）和小鼠单克隆抗NeuN抗体，抗GFAP或山羊多克隆抗Iba1抗体（1:300）在含有0.1%Triton X-10的0.01M PBS中共定位。山羊抗兔FITC（1:200，Chemicon公司），羊抗兔Cy3（1:200，Chemicon公司），羊抗小鼠FITC（1:200，Chemicon公司），驴抗兔Cy3（1:200，Chemicon公司），和驴抗羊FITC（1:200，Chemicon公司）作为第二抗体。将脑切片在4 ℃下与第一抗体依次孵育，然后在室温下与第二抗体孵育2小时。在荧光显微镜（Olympus BX 51）上检查染色切片。

统计分析

数据报告采用mean plusmn; SEM。（SPSS 10.0 for Windows, 1999, SPSS Inc. USA），本研究结果总结如下表。P＜0.05被认为存在统计学显著差异。

结果

缺血后的病理生理变化

MCAo（中脑动脉闭塞）后，rCBF（区域性脑血流）在缺血期间减少约50-60 %，并在再灌注后30分钟恢复至基线水平。缺血前30分钟和缺血后30分钟之间，平均动脉血压，PaO₂，PaCO₂，动脉血pH值和葡萄糖均无明显差异（表1）。

脑缺血诱导神经元损伤。在缺血核心，NeuN阳性神经元密度6小时内降低不明显，超过12小时，24小时和3天逐步减少，再灌注后7，14天和28天完全消失（图1 A，B）；在边界区，神经元密度在再灌注后24小时明显下降（图1 A，C）。

此外，神经功能缺损评分（图1 D）和梗死体积（图1 E）在缺血后再灌注24小时升高出现峰值，然后在再灌注后3，7，14和28天恢复。

表 1．总结手术前后生理变量

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