高度灵敏的醛类检测方法：适用于葡萄干和牛奶粉中的糠醛分析外文翻译资料

 2022-06-16 21:41:58

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高度灵敏的醛类检测方法：适用于葡萄干和牛奶粉中的糠醛分析

Yao Sun 1, Zhaobing Guan 1, Hongwei Cai, Yiyong Huang, Yawei Lin*, Xiaosong Hu**

武汉理工大学化学与化学工程与生命科学学院化学系，武汉430070

摘要：

基于硝酮形成的柱前荧光衍生化方法已被应用于确定糠醛（例如糠醛（F），5-甲基糠醛（5-MF）和5-羟甲基糠醛（5-HMF））食物样本第一次。 N-取代的羟胺试剂4 -（（羟基氨基）丁基）-7-羟基香豆素（HAHC）用于与糠醛的醛基反应形成稳定的具有高荧光强度的硝酮衍生物。反应在温和的条件下进行具有高衍生化产率（gt; 93％）的30分钟。三种糠醛衍生物的基线分离是随后在25分钟内在反相色谱柱上完成。检测限为低飞摩尔水平（S/N= 3，每次注射20mL）。校准曲线的线性范围为0.4e4000 nM具有良好的相关系数（R2=0.9991）。所提出的方法被进一步应用于食物样品分析，如牛奶粉和葡萄干。回收率令人满意范围为94.7％e103.5％。首先，这种柱前衍生方法简单，快速和高度为未来对不同基质中醛类的研究提供了有效且有前途的方法。

1.介绍

糠醛包括糠醛（F），5-甲基糠醛（5-MF）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）作为组重要的呋喃乙醛，可以在各种食品中找到，例如牛奶[1,2]，葡萄干[3,4]面包[5]，浓缩汁[6]，蜂蜜[7]，醋[8]和葡萄酒[9,10]等等。它们是由生成的热处理或热处理导致的糖类降解[11]储存时间长[3,9]。糠醛的外观会导致颜色，质地和味道在这些食品中的变化[12,13]。此外，几项研究指出F,5-MF和5-HMF可能具有致突变和遗传毒性[14,15]。这些化合物对人体中枢神经系统，肝脏，肾脏，心脏等器官的浓度有负面影响超过身体吸收的一定限度[16]。因此，它是对开发一种简单，快速和敏感的方法至关重要确定不同食品中糠醛的存在。

已经开发了许多方法，包括分光光度法[17,19]和色谱（例如气相色谱（GC）[10,20,22]和高性能液体色谱（HPLC））方法[23-26]。一方面，分光光度法更简单，成本更低它们常常受到基质效应的阻碍并且不足选择性。另一方面，使用Ultra-紫外检测（LC-UV）已用于糠醛测定在食品中，其检出限往往是10-3的数量级大大高于GC与质谱联用方法（GC-MS）。不幸的是，GC-MS经常需要几个分析步骤，包括提取和衍生在分析之前[21,27]。

HPLC方法与MS或荧光检测（FLD）具有很高的灵敏度和选择性，并且经常申请在给定的矩阵中进行高效分析。广泛用于增强疏水性和分析物的光谱响应，荧光衍生也已用于测定糠醛的HPLC-FLD分析。例如，Donnarumma等人[25]报道了用人血浆测定人血浆中5-HMF的含量荧光丹酰肼（DNSH）标记并且实现了低在皮摩尔水平的检测限（LOD）。

我们的实验室最近合成了一种醛反应剂4-（（羟基氨基）丁基）-7-羟基香豆素（HAHC）[28]。这种试剂已经表现出高量子态的良好荧光性质收益率为0.61。在HAHC中，香豆素充当荧光团核心和N-单取代的羟胺基团作为反应性基团结束（图1）。呋喃醛因此可以通过标记与HAHC缩合反应得到硝酮衍生物没有异构体形式（图2）。而且，长脂肪碳链也预计会增加衍生物的疏水性并改善其色谱行为[29]。

这项工作的目的是使用HAHC作为衍生化试剂来实现硝酮形成方法，其允许使用HPLC-FLD对食品中的糠醛进行定性和定量分析。优化若干反应参数以在温和条件下实现高衍生产率。 我们还研究了HAHC在荧光和质谱检测中标记糠醛的信号增强。 最后，该方法通过分析干葡萄干和牛奶粉样品中的糠醛来验证。 我们认为这种用N-取代的羟胺试剂衍生化方法在各种来源的醛的灵敏分析中具有很大的潜力。

2.实验

2.1材料和化学试剂

4 –((羟基氨基)丁基)-7-羟基香豆素（HAHC）在我们的实验室合成。 5-羟甲基糠醛，糠醛，5-甲基糠醛和丹酰肼购自J＆K Scientific（北京，中国）。 脂肪醛C1-C6包括甲醛（C1），乙醛（C2），丙醛（C3），丁醛（C4），戊醛（C5），己醛（C6）。 醋酸，醋酸钠，醋酸铵，磷酸，磷酸二氢钾，三氟醋酸，苯胺购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。 葡萄干从Tenwow食品有限公司购买（中国安徽牛奶粉）。购自蒙牛乳业有限公司（中国内蒙古）。 目前使用的所有试剂除非另有说明，研究是分析试剂级。过滤器（N66,13mmle;0.22mm）购自敬腾（天津，中国）。 超速离心管（再生纤维素，5KMWCO）购自MilliporeAmicon（MA，USA）。

2.2 设备和试剂

在具有20mL样品环的注射器，Shimadzu RF-20荧光检测器和色谱数据采集软的Shimadzu（Kyoto，Japan）LC-20A系统上进行色谱分析。 分离在反相HPLC柱上进行（Agilent Eclipse XDB-C18,5mm，4.6times;150mm）。 液相色谱级乙腈（ACN）购自Fisher Scientific（Pittsburgh，PA，USA）。 水是Milli-Q级。 在RF5301荧光光谱仪（Shimadzu，Tokyo，Japan）上记录荧光光谱，并在具有1_1cm石英池的Lambda 10 紫外/可见光光谱仪（Perkin-Elmer）上记录紫外/可见光光谱。 使用pH计（PB-10，Sartorius，USA）测定pH值。

2.3纳米 LC-ESI-MS分析

在具有纳流喷雾源的Triple-TOF 5600系统（AB SCIEX，USA）上测量电喷雾电离质谱（ESI-MS）。用C18（5mm，0.15mmtimes;150mm）柱在NanoLC Ultra System（Eksigent，USA）上进行样品分离的洗脱模式。柱温保持在25℃。用含有0.1％甲酸的乙腈 - 水（0.5 / 9.5，体积/体积）和乙腈 - 水（9.5 / 0.5，体积/体积）的溶剂A和B分别进行洗脱。使用25mL溶剂A和25mL甲醇溶液来溶解样品。将2.4mL等分的溶液以2.0mL min -1的流速加载到捕获柱中10分钟。使用流速为300nL min -1的梯度洗脱进行分析分离并使用3psi的离子源气体，35psi的帘幕气体，2.3kV的离子喷雾电压和界面加热器温度获得数据采集150℃。 ESI-MS采用正离子模式，质量范围为20e2000 m / z。应用IDA（信息相关性采集）模式扫描20个最丰富的前体离子，电荷数从1到4.使用PeakView 1.2软件（AB SCIEX，USA）处理结果数据。

2.4荧光分析

将HAHC溶于乙腈 - 水（1.0 / 9.0，体积/体积）至浓度为2mM。 对于发射光谱，激发波长保持在322nm，发射波长从350nm到600nm扫描。 对于激发光谱，发射波长保持在447nm，激发波长为200-400nm。

2.5衍生程序

在标准衍生化程序中，20mL的HAHC溶液（1mM），10mL标准糠醛溶液，10mL苯胺溶液（20mM）和10mL乙酸钠缓冲液（0.1M，pH3.5）在塑料离心管中混合。混合物保持在室温（20℃）30分钟，然后是高性能带有荧光检测的液相色谱（HPLC-FLD）分析。试剂空白通过相同的程序进行除了添加标准糠醛。

2.6色谱分离

样品通过使用C18柱的at HPLC系统进行分析激发时荧光检测的流速为1 mL min-1和322和447nm的荧光发射波长分别。分析前，C18色谱柱已预先平衡流动相30分钟20毫升的等分试样准备好的测试溶液被注入。柱温保持在30℃。洗脱遵循二元梯度分离。洗脱液A为乙腈 - 水（0.5 / 9.5，体积/体积）和洗脱液B乙腈。梯度：0-12分钟，13％B; 12-30分，20％B.

2.7HAHC和DNSH之后的色谱图比较

标签DNSH标记：三种糠醛的衍生化程根据参考文献[25]采用DNSH。注射三种糠醛的浓度均为0.02mM。色谱如参考文献所述进行分离[25]。激发和荧光发射的波长荧光检测器分别设定在350和525nm。该分离遵循二元梯度模式。洗脱液A是磷酸盐缓冲液（20mM，pH2.5）和洗脱液B是乙腈。

梯度：0-4分钟，30％B; 4-9分钟，30％B高达60％B.流量速度保持在1 mL min -1，保持柱温在30℃。

HAHC标记：三种糠醛的衍生化程序在第2.5节中有描述。三种注射剂浓度糠醛各0.02毫米。色谱分离是如2.6节所述。

2.8方法验证

通过分析标准混合物计算线性从LOQ开始，三种不同浓度的糠醛（信噪比= 10）值为4 mM。日内精密度通过六次重复标准测量糠醛样品在同一天和日间的精确度是通过在三天内使用相同的方法来确定。通过加标样品的分析确定回收率在中等和高浓度（0.4mM和1mM）之前样品制备程序。计算和预期加标样品的浓度（C）进行比较以确定恢复值使用以下公式：回收率=[ Cspiked sample / Cexpected]*100。

2.9样品制备

葡萄干：进行干葡萄干的样品制备根据参考文献[4]稍作修改。简而言之，5.0克样品在50mL离心管中精确称重。然后5mL的甲醇和20mL的0.02M乙酸铵溶液（用乙酸预先调节至pH 4.5）加入其中离心管并超声混合30分钟。上清液的混合物通过0.22mm过滤器（尼龙66）过滤，并在衍生之前转移到新的塑料离心管中。衍生化前将样品稀释10倍。

奶粉：样品预处理遵循程序如前所述[30]略有变化。简而言之，5.0克样品精确称重并用温水溶解至25mL。该溶液超声混合10分钟。然后1毫升随后向溶液中加入乙酸 - 水（2.5 / 7.5，体积/体积）通过加入甲醇至50mL的体积。混合物充分混合，然后在6000rpm下离心2小时带分子的超滤管（再生纤维素膜）重量截止5000 Da。然后过滤滤液通过0.22毫米的过滤器并转移到新的塑料离心机中管。衍生化前将样品稀释2.5倍。

3 结果与讨论

3.1与HAHC衍生化

HAHC是由作者合成的新型荧光试剂。HAHC的合成程序和表征都有在我们以前的工作[28]中已经描述过。激发和HAHC的荧光发射波长被确定为322和447纳米（图3）在我们最初的尝试中，我们选择F作为模型呋喃醛与HAHC在1h反应1h50℃，然后进行HPLC-FLD分析。与对照相比，在HPLC光谱中观察到一个新峰（保留时间：9分钟）被鉴定为F-HAHC衍生物（见图4A）。洗出液对应然后收集该峰并进行荧光和ESI-MS检测。由此产生的荧光谱图（图S1）显示F-HAHC衍生物和HAHC具有相同的lex和lem，表明FHAHC的荧光衍生物由HAHC部分决定。

通过ESI-MS检测m / z 328.12的离子（图4B），相应的到理论m / z值为的F-HAHC衍生物328.1182。此外，还需详细了解ESI-MS / MS谱图公开了F-HAHC衍生物离子可以在其上片段化碳 - 氮键和相邻的碳 - 氮双键到呋喃（图5）。主要碎片离子（m / z 217.09）属于到HAHC部分和不太突出的离子（m / z 81.03）属于糠醛部分。

总之，这些结果表明糠醛是成功的由HAHC标记，产生单一的F-HAHC硝酮衍生物。这一观察结果与以前的研究结果一致[31,32]，其中作者表明，醛与N-单取代的羟胺反应得到单一的硝酮产品无异构体形式。请注意标签试剂如2,4-二硝基苯肼（DNPH）[26]，DNSH[25]和O-（2,3,4,5,6-五氟苄基）羟胺盐酸盐

（PFBHA）[27]为每个糠醛提供两个峰值，因为它们的衍生物可以以E-和Z-异构体形式存在。在相反，我们的衍生化方法只产生一个明确的异构体，这简化了色谱图和便利糠醛混合物的分析。

3.2衍生化条件的优化

接下来我们使用单因素分析来研究各种参数这可能会影响衍生效率，其中包括反应时间，反应温度，pH值和衍生化试剂量。结果显示在图6中。我们使用的区域HPLC谱中的产物峰来估算衍生化效率。峰面积越大，衍生化越高

效率。

通过监测反应时间来研究反应时间的影响在50℃的水浴中进行反应。如图6A所示，糠醛衍生物的峰面积在反应时间达到平台4小时。因此，4小时被确定为最佳反应时间。反应温度进行了调查的范围内25℃-70℃。如图6B所示，衍生物的峰面积在50摄氏度时是最大的。当反应温度结束时50℃，衍生物的峰面积减少，这大概是由于硝酮衍生物在较高温度下的不稳定性。因此，50℃被确定为优化反应温度。

由于醛和羟胺的缩合是有利于酸性条件[33]，进一步优化衍生化反应在3.0-5.0的pH范围内进行醋酸钠缓冲液（图6C）。峰面积在pH 3.5时达到最大值并且该值被确定为最佳pH值。

通常，在荧光衍生中，过量的标记试剂需要确保衍生效率和可重复性。但是，过量的试剂可能会导致LC色谱柱过载和色

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