基于聚集诱导发光特性的新型荧光探针测定脂肪酶活性外文翻译资料

 2022-12-10 15:54:58

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基于聚集诱导发光特性的新型荧光探针测定脂肪酶活性

Jie Shi , Shan Zhang , Mingming Zheng , Qianchun Deng , Chang Zheng , Jing Li ,Fenghong Huang

摘要：脂肪酶在工业催化，药物发现和疾病的医学诊断中起着至关重要的作用。在本文中，基于考虑到具有-COOC6H13基团的四苯基乙烯（TPE）衍生物P1可以水解成在相同溶液中显示低溶解度的TPE-COOH，从而容易发生聚集，用化合物P1构建了具有聚集诱导发射（AIE）特征以快速观察脂肪酶活性的新型荧光开启探针。可以检测浓度低至0.1 mg mL-1的脂肪酶，脂肪酶的测定范围为0.1-1.3 mg mL-1。 另一方面，还总结了探针P1的选择性，酶反应的动态监测和初步的商业酶活性筛选。

关键词：聚集诱导发光；脂肪酶活性的测定；四苯乙烯；水解反应；Turn-on型荧光

1.引言

随着绿色与可持续化学的快速发展，已普遍采用生物催化合成高立体选择性和对映异构体纯的产品[1-5]。作为应用最广泛的生物催化剂的一个关键组分，脂肪酶（三酰基甘油酯水解酶，E.C. 3.1.1.3）是多功能的生物催化剂，可以催化多种类型的反应，如酯化、酯交换、氨解、水解、和许多在温和的条件下发生的重要的经典有机化学反应，产生了许多重要的化学物质，包括医药、农药、香料化合物、生物大分子和生物柴油[6-10]。因此，开发技术上的方便而有效的测定脂肪酶活性对于工业脂肪酶的优化和药物发现和疾病诊断是非常重要的。到目前为止，脂肪酶活性测定方法非常少见。作为报告者，通过使用Tween 20功能的GNP（金纳米颗粒），霍和田开发了比色探针[11]。J.F. Jette和E. Ziomek描述了一种基于血清甘油三酯酶解过程中释放的脂肪酸和Rhodamine B相互作用的定量脂肪酶法[12]。

另一方面，众所周知，荧光测定非常重要，因为它具有无与伦比的灵敏度，简便性，快速实施和高通量筛选的适用性[13-17]。具有聚集诱导发光（AIE）特征的荧光团最近已经成为用于生物传感和成像应用的有希望的材料[18]。不同于由于强pi;-pi;相互作用而高浓度荧光猝灭的常规荧光团，当其分子聚集或结合特定分析物时，AIE发光体如四苯乙烯（TPE）及其衍生物具有高发射效率[19-21]。迄今为止，已经报道了大量基于AIE的“开启”生物传感器，目的是以更高的灵敏度靶向蛋白质、核酸和葡萄糖[22-37]。最近，报道了一些基于AIE的探针，以检测特异性酶，如胱天蛋白酶，MMPs，ACE和SIRTs，并为生物探针设计提供了最佳性能的新机会[38-43]。然而，有趣的是，没有关于其在脂肪酶活性测定中的应用的报道。通常，脂肪酶可以催化连接到发光体的酯基的水解，然后改变本身的性质，从而导致荧光的变化。另一方面，报告的脂肪酶测定法仍然存在一些缺点，在这些以前的工作中，已经使用一些特异性底物和指示剂测定作为主要筛选工具，然而，所有这些都具有相对复杂的生产过程并且不方便地合成，其中有些人需要费力的准备程序。因此，开发一种简单和敏感的脂肪酶生物传感器是必不可少的。

在这里，我们通过操纵探针P1的聚集和解聚合来报告脂肪酶活性的新的荧光开启测定。整个设计原理如方案1所示，说明如下：（1）探针P1是衍生自具有酯基的四苯基乙烯（TPE）。众所周知，TPE及其衍生物显示AIE（聚集诱发发射）行为;当它们溶解在有机溶剂中时它们几乎是非荧光的，但在聚集后它们变得强烈发射。事实上，已经基于AIE特征公开了各种化学/生物传感器; （2）由于存在长烷氧基-COC6 H 13基团，所以预期探针P1可溶于某种溶剂，因此根据先前的研究，探针P1在溶剂中弱发射;（3）脂肪酶催化裂解探针P1中的酯基会诱导P1转化为TPE-COOH，将-COC6 H 13单元切断，从而将不溶性TPE残留物（TPE-COOH）释放到溶剂。因此，TPE-COOH在溶剂中的聚集将发生并导致强烈的发射，也就是说导通荧光。以这种方式，可以通过探针P1建立脂肪酶活性的简单荧光“开启”测定，通过该途径，实现了高灵敏度和选择性的脂肪酶活性的检测。据我们所知，这是首次使用AIE发光体作为荧光指标来评估脂肪酶活性。我们认为，筛选脂肪酶活性的研究不仅将扩大基于AIE发光体的酶测定谱，而且还可以刺激基于AIE的新靶标测定的发展。

2.实验

2.1材料

所有的化学制品和试剂均可商购获得并且不经进一步纯化即可使用。将四氢呋喃（THF）干燥并在干燥氮气下从K-Na合金中蒸馏出。4-二甲基氨基吡啶（DMAP），4-溴二苯甲酮，正丁基锂购自Aldrich。 二环己基碳二亚胺（DCC），对甲苯磺酸（PTSA）一水合物购自Acros Organics。 来自洋葱假单胞菌的脂肪酶（PCL），南极假丝酵母脂肪酶B（CALB），猪胰腺（PPL），假丝酵母（CRL），荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）（PFL），黑曲霉（ANL）的脂肪酶均从Novozymes订购。 胱天蛋白酶-3，溶菌酶，胃蛋白酶，来自人血清的白蛋白（HSA），酰基转移酶，葡萄糖氧化酶，alpha;-淀粉酶，胰蛋白酶和漆酶均购自Sigma-Aldrich。 根据先前的文献合成1-（4-溴苯基）-1,2,2-三苯乙烯（TPE-Br）[44]。

2.2仪器仪表

使用四甲基硅烷（TMS；delta;= 0ppm）作为内标用Varian Mercury 300光谱仪进行1H和13C NMR光谱研究。 在具有Xe灯作为激发源的Hitachi F-7000荧光分光光度计上形成荧光光谱。 元素分析由73 CARLOERBA-1106微元素分析仪进行。 用Finnigan PRACE质谱仪记录EI-MS光谱。 用商业激光散射仪（Malvern ZEN3690，Malvern Instruments）在25℃下进行动态激光散射（DLS）测量。

2.3合成

2.3.1合成4-（1,2,2-三苯基乙烯基）苯甲酸（TPE-COOH）

根据报道的文献合成1-（4-溴苯基）-1,2,2-三苯乙烯（TPE-Br）。在蒸馏过的THF（80ml）溶液中溶解TPE-Br（6.0mmol，2.466g），在78℃，N2环境下逐滴加入5.0mL（12.0mmol）正丁基锂溶液（2.4M，在己烷中）。将反应混合物搅拌并保持在78℃2小时。一次加入过量的干冰，然后在室温下搅拌6小时。所得溶液用过量的1M盐酸酸化，并用DCM萃取三次。将有机层合并并用Na2SO4干燥。过滤后，除去溶剂得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱纯化，得到所需产物（1.93g，5.13mmol），为白色固体。产率：85％。 1 H NMR（300MHz，CDCl3）：delta;（TMS，ppm）7.91-7.86（d，2H），7.19-7.09（m，11H），7.06-6.98（m，6H）。 13 C NMR（75MHz，CDCl3）：delta;（TMS，ppm）172.64,150.11,143.79,143.52,143.39,142.97,140.31,130.97,130.73,130.17,128.43,127.97,127.34,126.41,126.08,125.72。

2.3.2化合物P1的合成

向DCM溶液中加入TPE-COOH（1.5mmol，0.565g），DCC（2.25mmol，0.464g），DMAP（0.3mmol，0.036g），PTSA单乙酸盐（0.3mmol，0.057g）和1-己醇 6.0mmol，0.445g）。 将反应混合物在室温下搅拌24小时。 溶剂蒸发后，粗产物通过硅胶色谱纯化，得到目标产物（0.32g，0.74mmol），为凝胶状固体。 产率：49％。 1 H NMR（300MHz，CDCl3）：delta;（TMS，ppm）7.78（d，2H），7.11（br，11H），7.03-7.01（m，6H），4.26（t，2H），1.72（t，2H ），1.41-1.26（m，6H），0.89（br，3H）。13 C NMR（75MHz，CDCl3）：delta;（TMS，ppm）166.53,148.62,143.18,143.09,142.28,139.91,131.21,128.89,128.17,127.78,127.64,126.77,126.65,64.98,31.40,28.61,25.64,22.48 ，13.97。 MS（EI），m / z [M]：460.24，（计算值：459.98）。元素分析值：C 33 H 32 O 2：C，86.05; H，7.00。 实测值：C，86.29; H，6.89。

2.4制备P1和脂肪酶的溶液

通过将P1固体（0.46mg）溶于己烷（10mL）中来制备P1（1times;10 -4 M）的储备溶液。 通过放置0.1mL P1储备溶液制备P1（1M）在己烷中的溶液，然后用己烷稀释至10mL。 对于一系列商业购买的浓度梯度（0.1-1.3mg mL-1）脂肪酶（CALB）样品溶液和用于初步筛选的其它商业脂肪酶（1.0mg mL-1）溶解在由K2HPO4和KH2PO4制备的0.1M磷酸钾缓冲液（pH=7.0）中。

2.5脂肪酶活性测定和动态监测酶水解

2mL不同浓度的脂肪酶储备溶液（0.1-1.3mg mL-1）与2mL1M P1溶液在10mL烧瓶中混合并在室温下搅拌20分钟。 然后使有机层进行激发波长为350nm的荧光测量。 通过以120秒的间隔扫描的荧光光谱测量来监测酶水解过程。

3.结果与讨论

3.1 P1的设计，合成和结构表征

设计原理如方案1所示。众所周知，酯基的水解可以通过脂肪酶进行，因此这种刺激方式可以通过简单的反应激活荧光反应。P1中的酯键被脂肪酶催化水解裂解生成TPE-COOH，然后由于其由-OC6H13基团松散引起的较低的溶解度，可以触发相同溶液中TPE-COOH的快速聚集。

方案1 在脂肪酶活性测定中探针P1的检测机理的示意图

使用方案2中描述的合成方案合成生物传感器P1，并从4-溴二苯甲酮和二苯基甲烷开始，得到化合物TPE-Br，其用1-己醇酯化，得到探针P1。 通过1 H NMR，13 C NMR，EI-MS和元素分析确定P1的结构和纯度。

方案2 探针P1的合成路线

3.2 TPE-COOH的AIE性能

如上所述，我们假设脂肪酶活性的测定主要通过监测属于TPE-COOH形成的荧光来完成。 因此，TPE-COOH的AIE性质对我们的研究至关重要。 我们首先研究了聚合状态下TPE-COOH的光物理性质。 使用THF和己烷溶剂混合物研究了TPE-COOH的荧光性质（图1）。 TPE-COOH在纯THF溶液中几乎不发射。 随着己烷含量从0到60％的增加，荧光强度保持在较低水平。 进一步向混合物中加入己烷导致荧光强度的急剧和显著提高。 在95体积％己烷含量下，荧光强度比纯THF溶液高约49倍，表明化合物TPE-COOH是AIE活性的。

图1 （A）TPE-COOH（1mu;M）在具有不同馏份己烷（fnof;H）的THF-己烷混合物中的荧光光谱。（B）I / I 0在425nm处与fnof;H的关系图，其中I 0是纯THF溶液中的荧光强度。激发波长350 nm

3.3 脂肪酶活性测定

显然，探针P1及其前体TPE-COOH的溶解度和排放行为的差异启发我们利用探针进行脂肪酶活性测定。脂肪酶可以高效率地催化单酯与羟基的水解反应。由于酶产物TPE-COOH不溶于一些较差的溶剂，因此会形成聚集体以开启荧光。因此，P1可以作为脂肪酶活性记录。为了检查这种设计的可行性，我们研究了探针P1在己烷中用脂肪酶缓冲溶液处理时的荧光变化。制备了生物传感器P1（1.0M）的己烷溶液用于荧光光谱研究，并选择南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）来评价P1的性能。如预期的那样，探针P1（1.0M）的荧光强度在测试条件下非常弱，即使在黑暗的室内也可以看到几乎没有光致发光（参见图2）。然后，我们尝试向探针P1的稀释溶液中添加一些脂肪酶，快速地，与脂肪酶缓冲溶液混合后蓝色荧光发射开启。如图所示。如图2A所示，添加脂肪酶后，有机相的荧光强度开始增加;即使在脂肪酶浓度低至0.1mg mL-1时，脂肪酶浓度也随之增加。当探针/脂肪酶复合物中脂肪酶的浓度达到1.1mg mL-1时，与空白相比，荧光强度增加了17倍。加入1.3mg mL-1脂肪酶后，荧光逐渐增加，强度达到高原。这证实了我们上述的想法：伴随着在一些脂肪酶存在下与TPE核心连接的酯基团的烷氧基链的泄漏，其聚

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