亚磷酸盐脱氢酶高效再生NADPH的研究外文翻译资料

 2023-01-05 14:05:56

亚磷酸盐脱氢酶高效再生NADPH的研究

原文作者：Tyler W. Johannes,1 Ryan D. Woodyer,2 Huimin Zhao1,2

单位：伊利诺斯州大学化学与生物分子工程系，伊利诺斯州厄巴纳-香槟，马瑟斯大道600号，伊利诺斯州厄巴纳61801；电话: ( 217 ) 333 - 2631;传真: (217) 333-5052; e-mail: zhao5@uiuc.edu.

伊利诺斯州大学化学系，伊利诺斯州厄巴纳-香槟分校，伊利诺斯州厄巴纳市马修大街600号，61801。

摘要：还原烟酰胺辅因子(NAD(P)H)的原位再生对于许多重要化学物质的实际合成是必要的。在此，我们报道了一个高稳定和活性的突变型亚磷酸脱氢酶(12x-A176R PTDH)的工程设计，并评价了它作为酶膜反应器中NADPH再生系统的潜力。以木糖还原酶催化木糖醇合成和醇脱氢酶催化(R)-苯乙醇合成两个实际上重要的酶促反应为模型体系，并与市售NADP 特异性假单胞菌sp.101甲酸脱氢酶(mut Pse - FDH)进行了直接比较。广泛用于NADPH再生。在两种模型反应中，两种再生酶的酶活性损失率相似；然而，突变体PTDH显示出比mut Pse - FDH更高的底物转化率和更高的NADP 总周转数。突变体PTDH的时空产率也比mut Pse - FDH高4倍。特别地，使用带电纳滤膜用突变体PTDH获得230 g·L-1d-1木糖醇的时空产率，与基于酵母D -木糖转化菌株或类似体外酶膜反应器系统的木糖醇合成的其它现有生物方法相比，表现出最高的产率。

关键词：辅因子再生 NADPH再生 酶膜反应器 生物催化

介绍

酶是多用途的催化剂，具有合成毫克量的有价值化合物或在工业上生产成千吨规模的散装化学品的能力。随着基因组学和宏基因组学的最新进展，已经发现了许多可能具有合成应用的新酶。然而，许多这些合成有用的酶未得到充分利用，因为它们需要一种或多种昂贵的辅因子(Woodyer等，2004年；Zhao 和 van der Donk，2003 )。特别地，氧化还原酶催化许多工业上重要的反应，例如产生非天然氨基酸、多元醇和手性醇，但通常需要烟酰胺( NADH或NADPH )作为辅因子(Hummel和 Kula，1989； Krix等人，1997年)。这些烟酰胺辅因子，特别是其还原形式的烟酰胺辅因子，太昂贵而不能以化学计量的量使用，因此需要原位再生用于大规模合成。

(van der Donk和Zhao，2003；Wichmann 和Vasic-Racki，2005年)已经建立了许多用于再生还原烟酰胺辅因子NADH和NADPH的化学、电化学、光化学和酶促方法，并且最近对其进行了综述。与酶法相比，化学、光化学和电化学方法通常缺乏实现高总周转数所需的高选择性。例如，如果将NAD (P)还原为NAD(P)H对于氢化贡献到烟酰胺环的四个位置是95 %选择性的，则100次翻转后辅因子的剩余活性将是(0.95)100asymp;0.6 %。因此，大多数化学方法、光化学方法和电化学方法对实际应用缺乏足够的选择性。目前，用于再生还原烟酰胺辅因子的最方便和实用的方法基于酶再生系统，其中对牺牲底物具有高特异性的第二种酶与生产反应偶联(van der Donk和Zhao，2003)。

目前可用于NAD(P)H再生的酶系统包括用于NADH的甲酸盐/甲酸脱氢酶、用于NADH的异丙醇/醇脱氢酶(Pseudomonas sp.)、用于NADH和NADPH的异丙醇/醇脱氢酶(T. brockii)、用于NADH和NADPH的H2 /氢化酶(M. thermoautotrophicum)、用于NADH和NADPH的葡萄糖- 6 -磷酸/葡萄糖- 6 -磷酸脱氢酶(L. mesenteroides)和用于NADH和NADPH的葡萄糖/葡萄糖脱氢酶( Hummmel，1999；Wichmann和Vasic-Racki，2005)。其中，以甲酸脱氢酶(FDH)为基础的酶法NAD(P)H再生体系应用最为广泛。事实上，博伊迪尼假丝酵母的FDH是目前工业上唯一使用的酶系统。Degussa使用FDH以多吨规模生产氨基酸衍生物L -特特勒鲁西(Tishkov和Popov，2006)。不幸的是，野生型FDH对NADPH再生不够有效；然而，合理的设计已经被用来从假单胞菌产生NADP 特异性的FDH sp. 101(mut Pse-FDH)(Tishkov et al., 199)。该酶已成功地与醇脱氢酶(Seelbach等，1996)和单加氧酶(Rissom等，1997)结合使用，分别合成了雷康醇和手性内酯。最近从Stutzeri假单胞菌(Costas等)发现的亚磷酸脱氢酶(PTDH，2001)在某些应用中可能具有优于其FDH对应物的几个实际优点。PTDH的优点包括高热力学平衡常数(Keq=1*1011)、宽的最大pH值、便宜的亚磷酸酯底物，该底物亚磷酸酯和产物磷酸酯都是无毒的，并且充当缓冲剂，并且如果需要，可以通过钙沉淀容易地除去磷酸酯(Relyea和van der Donk，2005；弗蒂斯等人，2002年)。由于其非常高的平衡常数，PTDH催化亚磷酸酯几乎不可逆地氧化成磷酸盐，并伴随着NAD 还原成NADH(Costas等，2001年)。由于野生型PTDH很难接受NADP 作为底物，因此采用合理的设计来产生双突变体PTDH(E175A和A176R)，其可以高效地成功地还原NAD 和NADP (Woodyer等，2003年)。此外，定向进化被用于显著改善热稳定性(Johannes等，2005)，表达水平和PTDH的活性(Woodyer等，2006年)。工程热稳定突变体PTDH(12x)在458C表现出比野生型PTDH长7，000倍以上的热失活半衰期，并且包含辅助因子特异性突变(E175A)中的一个和除两个以外的所有有助于提高PTDH ( T181S和A308T )的活性/表达的突变(Johannnes等，2005年)。

在本研究中，我们使用定点诱变将其它辅因子特异性突变(A176R)结合到来自Stuzzeri假单胞菌的12x突变体PTDH中，以产生新的稳定且高效的NADPH再生酶。然后在酶膜反应器中证明了PTDH突变体的稳定性和有效性，用于生产五碳糖醇木糖醇和手性醇(R) -苯乙醇。我们还将我们的系统与基于合理设计的mut Pse - FDH的最佳可用NADPH再生系统进行了直接比较。

材料和方法

材料

异丙基- B- D -硫代半乳糖苷(IPTG)、D -木糖、木糖醇、溶菌酶、亚磷酸钠、甲酸钠、二甲亚砜(DMSO)和氨苄青霉素购自Sigma - Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。苯乙酮和(R)- (alpha;)-苯乙醇购自兰开斯特合成公司(Windham，NH)。大肠杆菌BL21(DE3)和质粒pe15b从诺瓦根(麦迪逊，威斯康星州)购买。PfuTurbo DNA聚合酶是从美国加利福尼亚州拉霍亚根获得的。限制性内切酶NdeI和BamHI以及T4 DNA连接酶购自新英格兰Biolabs (马萨诸塞州贝弗利)。PCR等级的dNTPs从罗氏应用科学公司(印第安纳波利斯，IN)获得。寡核苷酸引物从整合DNA技术(科拉尔维尔，IA)获得。QIAprep旋转质粒微型制备试剂盒、QIAEX II凝胶纯化试剂盒和QIAquick PCR纯化试剂盒从Qiagen (加利福尼亚州巴伦西亚)购买。BD talotm金属亲和树脂购自加州帕洛阿尔托的BD生物科学克隆技术公司。Amicon超15离心过滤装置和YM3超滤膜( NMWL，3kda )从Fisher Scientific (宾夕法尼亚州匹兹堡市)购买。NTR 7410 -荷电纳滤膜购自Somicon AG (瑞士巴塞尔)。NADP ，假单胞菌sp.101 NADP -特异性甲酸脱氢酶( mut Pse - FDH)、短乳杆菌乙醇脱氢酶( ADH - LB )和10 mL不锈钢反应器购自Ju lich手性溶液有限公司(Ju lich，德国)。

定点诱变(A176R→12x)

使用大引物定点诱变方法将突变A176R引入12x模板(Sarkar和Sommer，1990)。将该基因侧翼的两个寡核苷酸引物与诱变正向引物(下划线密码子编码所需氨基酸取代) 50 - CAG TAC GCG CGG AAG GCT GAT - 30结合使用。利用NdeI和BamHI限制性位点将定点突变基因克隆到pET15b中。得到的pET15b- 12x - A176R构建体在T7启动子的控制下，表达12x - A176R作为N末端His 6 -标签融合蛋白。然后通过热激将质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，并在含有氨苄青霉素的Luria - Bertani (LB)固体培养基上选择。质粒使用BigDyeTM终止子测序方法和ABI棱镜3700测序仪(应用生物系统，Foster City，加利福尼亚州)进行测序。

12x - A176R和ncXR的过表达和纯化

粗脉孢菌木糖还原酶(ncXR)和12x - A176R突变体PTDH的蛋白质纯化使用在其它地方描述的方案进行，但有一些修饰( Woodyer等，2005年)。使用生物LP快速高效液相色谱系统( Bio - Rad )和填充有30 mL IMAC Co2 树脂( Talon )的柱，在单步骤IMAC纯化过程中表达和纯化his 6标记的酶。用Millipore Amicon 8400搅拌的超滤池在48℃用50 mM MOPS缓冲液( pH =7.25 )脱盐和浓缩合并的活性级分。然后在808℃下将酶尽可能浓缩(gt; 10 mg / mL )储存在10 %甘油中。

酶动力学

野生型和突变型PTDHs的动力学常数如(Woodyer等人。2003年)处所述测定。通过监测NADPH(6.22 mM-1cm -1)在340 nm处吸光度的增加来确定初始反应速率。初始速率在258C使用瓦里安Cary 100生物紫外-可见分光光度计进行。通过加入3 mg PTDH引发反应。通过测量A280(30 mM-1cm-1)测定酶浓度。NADP 原液的浓度通过紫外-可见光谱测定(260 nm处18 mM-1cm-1)。亚磷酸酯浓度通过测定在饱和NADP 和过量PTDH酶存在下产生的NADPH的量来酶促测定。使用至少五种浓度的每种底物，从低于KM值变化到高于KM值至少五倍，而另一种底物保持恒定的饱和浓度。使用Origin 5.0(Origin inlab Corporation，北安普敦，马萨诸塞州)通过拟合米切里斯-门登方程来计算动力学常数。除了在25℃处(Serov等人，2002)之外，使用与其它地方报道的类似条件来测定具有NADP 的mut Pse - FDH的动力学参数。

有机溶剂稳定性

在每种酶以0 %至60 % DMSO的浓度温育10小时后，测定野生型(WT)PTDH、12x - A176R突变体或mut Pse - FDH在有机溶剂存在下的稳定性。如前所述，通过监测NADPH在340 nm处吸光度的增加来测量溶剂处理后剩余的酶活性，并以原始活性的百分比表示。

批量生产( R ) -苯乙醇

小规模分批再生反应包含50 mM亚磷酸钠(100 mM甲酸钠用于mut PseFDH )、20 mM苯乙酮、0.2 mM NADP 、1.4U/ mL短杆菌乙醇脱氢酶( ADH - LB )和0.67 mg / mL再生酶(野生型PTDH、12x-A176R或mut Pse - FDH )。所有反应均在pH7.0下进行。在50 mM磷酸钠缓冲液中进行涉及mut Pse - FDH的反应。轻轻混合反应并在25℃温育。每10分钟，从反应中取出样品并立即在20℃冷冻。冷冻样品在分析前立即解冻。采用高效液相色谱法对苯乙酮催化转化为( R ) -苯乙醇进行了研究。安捷伦1100系列溶剂选择器、泵、色谱柱和检测器模块与Zorbax 150 mm times;3.0 mm SB C - 18 (3.5 mu;m )色谱柱配合使用。流速为0.8 mL / min，温度为258C。使用乙腈/ 25 mM NaH2PO 4缓冲液pH 2.1 (40∶60v / v)的等度洗脱分离底物和产物，并在260 nm处分光光度法测定。(R) -苯乙醇的保留时间为1.9分钟，苯乙酮的保留时间为2.8分钟。每个反应进行并分析至少两次，所报告的值是两次测量的平均值和相关的标准偏差。

连续生产( R ) -苯乙醇

在10 mL不锈钢酶膜反应器(EMR)中用Amicon YM3超滤膜连续生产(R)-苯乙醇，如别处所述(Kula和Wandrey，1987)。反应器通过磁力搅拌器连续混合。最初将牛血清白蛋白(BSA)(10 mg)泵入反应器中以提高膜的效率以保留辅因子并防止其它酶吸收到膜上。通过样品口将酶单独直

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