一种基于β-二酮-铕(III)络合物的荧光探针，用于活细胞中铜和硫化物离子的高灵敏度时间封闭发光检测外文翻译资料

 2023-03-13 10:50:36

一种基于beta;-二酮-铕(III)络合物的荧光探针，用于活细胞中铜和硫化物离子的高灵敏度时间封闭发光检测

作者：Yiren Wang,Huan Wang,Xing Zhao,Yuting Jin,Houqing Xiong,Jingli Yuan and Jing Wu

摘要：我们开发了一种新型的基于beta;-二酮酸-铕(Ⅲ)配合物的荧光探针Eu3 -BHHCT-BPED，通过引入含有Cu2 结合二吡啶胺(DPA)的N,N-双(2-吡啶甲基)乙二胺(BPED)成四齿beta;-二酮配体4，4-双(1',1',1',2',2',3',3'-七氟-4',6'-己二酮-6'基)氯磺邻三苯基。该探针具有强荧光，具有高量子产率(57.6%)和长发光寿命(0.81ms)。添加Cu2 离子后，由于Cu2 离子与BPED部分的配位，Eu3 -BHHCT-BPED在607nm的荧光发射被选择性且有效地淬灭。此外。得到的异双金属配合物Eu3 -BHHCT-BPED-Cu2 显示出对硫化物离子的特定发光响应。因为CuS的形成诱导了可逆的荧光恢复。Eu3 -BHHCT-BPED对Cu2 和硫化物离子的“开-关-开”型信号行为，使这两种物质的检测限分别为3.7nM和0.19mu;M。时间封闭发光成像研究证明了Eu3 -BHHCT-BPED可用于以高灵敏度和选择性监测细胞内Cu2 和硫化物离子。

1.引言

铜离子是人体中第三丰富的过渡金属，在机体的造血、铁吸收、酶催化和氧化还原反应等各种生理过程中发挥着关键作用。同时，它还能催化活性氧(ROS)的形成，对生物分子造成损伤。研究表明，细胞中铜含量高与嗜睡、血压升高、急性溶血性贫血、肝损伤和神经退行性疾病有关。硫化氢(H2S)长期以来被认为是一种带有臭鸡蛋气味的环境有毒气体。近年来，H2S在生物体内的作用引起了广泛的研究兴趣。H2S被认为是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种内源性信号气体递质，参与缺血再灌注损伤、凋亡、神经调节、炎症和胰岛素信号转导等多种生理过程。H2S水平异常与许多疾病有关，如阿尔茨海默病和唐氏综合症。因此，为了更深入地了解Cu2 和硫化物离子的生理和病理功能，迫切需要开发一种敏感和选择性的实时监测和可视化方法。

迄今为止，许多分析方法已被应用于Cu2 和硫化物离子的检测，包括比色法、紫外-可见分光光度法、电感耦合等离子体到mic发射光谱法和荧光光谱法对Cu2 离子的检测，以及硫化物沉淀，硫化物离子的电化学、化学发光和荧光光谱分析。在这些方法中，荧光探针技术以其高灵敏度、高选择性、无创检测、操作简便等优点成为一种很好的工具。特别是，通过荧光显微镜，可以在活体生物系统中原位测定和观察各种反应物种。最近，一些基于有机荧光团的Cu2 探针已经被开发出来，并在生物分析应用中取得了一些成功。根据还原反应、淬灭反应和亲核反应三种策略，设计了多种用于硫化物选择性检测的有机探针。然而，这些有机染料荧光探针的光稳定性差，自身荧光干扰强，在一定程度上阻碍了其在活体成像中的实际应用。

作为一种改进，许多镧系(III)配合物(主要是Eu3 和Tb3 配合物)作为响应探针被广泛应用于生物领域。这允许使用时间封闭检测模式来消除生物自荧光和散射光，提高信噪比和灵敏度。迄今为止，已经报道了几种镧系(III)络合物荧光探针用于检测Cu2 离子和硫化物离子。然而，这些镧系化合物(III)与多酸衍生物配体具有较低的发光量子产率。此外，能够用于识别活细胞中Cu2 和硫化物离子的高效探针还很少见。因此，基于镧系(III)络合物的强荧光探针对于追求细胞的高灵敏度分子成像具有极大的吸引力。

在这项工作中，一种新的beta;-二酮-铕(III)配合物荧光探针，Eu3 -BHHCT-BPED,设计并合成Cu2 和硫离子的检测活细胞通过使用四配位基的beta;-二酮配体,4,4-双(1',1',1',2',2',3',3'-七氟-4',6'-己二酮-6'基)氯磺邻三苯基(BHHCT),附加的二甲基吡啶胺(DPA)包含N,N-双(2-吡啶甲基)乙二胺(BPED)。Eu3 配合物表现出强烈的荧光，量子产率高(57.6%)。在与Cu2 配位后，由于BPED-Cu2 配合物部分的形成，其在607nm处的荧光发射几乎完全猝灭。然后加入硫化物离子(本文以Na2S为硫化物源)，通过形成CuS去除配位的Cu2 ，使淬灭探针的荧光恢复。Eu3 -BHHCT-BPED的荧光强度下降和反向增加分别与Cu2 和硫化物离子浓度呈线性相关。因此，Eu3 配合物可作为水介质中识别Cu2 和硫化物离子的时间封闭荧光探针。此外，新探针对细胞内Cu2 和硫化物离子的时间封闭发光成像的适用性也得到了成功的证明。图1为Eu3 -BHHCT-BPED的结构及其与Cu2 和硫化物离子的发光反应。

2.实验阶段

材料

按照文献报道的方法合成了BHHCT和BPED化合物。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自Acros Organics。二氯甲烷(CH2Cl2)和乙腈(CH3CN)经适当蒸馏和纯化后使用。培养的HepG2细胞来自大连医科大学。本实验室制备了含140mmolNaCl、10mmol葡萄糖和3.5mmolKCl的等渗盐水溶液。除非另有说明，所有化学材料均购自商业来源，未经进一步净化而使用。

方法

用Bruker Avance谱仪(400MHz)记录1H NMR谱。用HP 1100LC/MSD质谱仪测定ESI-MS谱。在Vario-EL分析仪上进行元素分析。吸收光谱在帕金-埃尔默Lambda 35紫外-可见光谱仪上测量。采用Perkin-Elmer LS 50B荧光光谱仪，测量条件如下：延迟时间为0.2ms;闸门时间为0.4ms;循环时间为20ms;激发狭缝为10nm;发射狭缝为10nm。在爱丁堡仪器公司的FS5荧光光谱仪上测量了发光寿命。在含有0.1%CTAB的pH7.4的0.05M硼酸盐缓冲液和Eu3 配合物中测定Eu3 -BHHCT-BPED和Eu3 -BHHCT-BPED-Cu2 的相对发光量子产量.Eu3 -N,N,N1,N1-(4′-苯基2,2′:6′,2Prime;-三吡啶-6,6Prime;-二基)双(甲苯基)四乙酯(乙酸酯),作为参照(=0.16)。所有的亮场和发光成像测量都是在实验室使用真色度时间封闭发光显微镜上进行的。

BHHCT-BPED的合成

将BPED(35mg，0.12mmol)溶解在6mL无水CH2Cl2中，然后将BHHCT(100mg,0.12,0.12 mmol)、0.15mL三乙胺(Et3N)和二甲胺吡啶(2.9mg，0.024mmol)加入溶液中。将反应混合物在室温黑暗中搅拌5天。溶剂蒸发后，用80mL稀释的盐酸(1.0M)洗涤残渣，然后用200mL的CH2Cl2溶解。溶液用120mL水洗涤3次，用Na2SO4干燥。蒸发后，配体BHHCT-BPED为黄色固体(120.5mg，产率89%)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：(ppm)=1.25(s,1H)、1.80(m,4H)、3.98-4.01(d,4H；J=12.0Hz)、6.56(d,2H；J=5.2Hz)、7.04(m,4H)、7.23-7.21(d,4H；J=8.0Hz)、7.77-7.86(d,8H;J=12.0Hz)、8.61(m,4H)。ESI-MS(m/z):1011.3([M H] ,100%,计算值1011.2). C44H34F14N4O7S(BHHCT-BPED·H2O)的元素分析(%):C,51.37;H,3.33;N,5.45;文献值(%):C,52.28;H,3.19;N,5.54。

Eu3 -BHHCT-BPED的合成

将BHHCT-BPED(506mg,0.5mmol)和铕(Ⅲ)三氟酸酯(92mg,0.25mmol)溶解在6.0mL CH3CN中，然后滴加入0.5mLNaOH溶液(8mg/mL)。将反应混合物在室温下搅拌24h。蒸发后，用水和乙醚洗涤，得到目标配合物为浅色粉末(120.5mg,产率89%)。ESI-MS(m/z):2170.9([M-Na]-,100%,计算值2170.3).C90H63EuF28N9NaO12S2(Eu(BHHCT -BPED)2·Na ·CH3CN):C,48.72;H,2.79;N,5.16;文献值(%):C,48.40;H,2.84;N,5.64。

Eu3 -BHHCT-BPED原液的制备

将BHHCT-BPED(1mmol)和EuCl3·6H2O(0.5mmol)在乙醇中原位配合，制备了配合物Eu3 -BHHCT-BPED的原液。获得的原液在4°C下保存，用含0.1%CTAB的pH为7.4的0.05M硼酸盐缓冲液适当稀释。

Eu3 -BHHCT-BPED对各种金属离子的发光响应

Eu3 -BHHCT-BPED与不同金属离子的反应在含0.1%CTAB的pH7.4的0.05M硼酸盐缓冲液中进行，并加入相同浓度的Eu3 -BHHCT-BPED。将溶液在室温下搅拌30min，然后进行时间封闭发光测量。

Eu3 -BHHCT-BPED-Cu2 对各种阴离子的发光响应

Eu3 -BHHCT-BPED-Cu2 溶液由Eu3 -BHHCT-BPED(0.5M)与Cu2 (1M)在室温下，在含0.1%CTAB的pH7.4的0.05M硼酸盐缓冲液中反应30min制备。加入各种阴离子后，再搅拌溶液45min，然后进行定时发光测量。

HepG2细胞中Cu2 和硫化物离子的发光成像

HepG2细胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素，37°C，5%CO2/95%空气的RPMI-1640培养基的玻璃底培养皿(20mm)培养。用等渗盐水洗涤三次后，细胞与含有Eu3 - BHHCT-BPED(2.5M)和C40(0.001%)的等渗盐水在37°C恒温箱中恒温1小时。将Eu3 - BHHCT-BPED负载细胞用等渗生理盐水洗涤3次，然后用不同浓度的Cu2 (0.5和2.5M)恒温30min。洗涤后，将Eu3 -BHHCT-BPED-Cu2 负载细胞在真色度发光显微镜(激发滤光片,330 -380nm;二色镜,400nm；;滤光片,gt;590nm)上进行发光成像测量。在曝光时间为1.1s时记录稳态发光图像，并在以下条件下记录时间封闭发光图像：延迟时间为33s；栅极时间为1.0ms；曝光时间为1.1s。Eu3 -BHHCT-BPED-Cu2 负载细胞为恒温Eu3 -BHHCT-BPED负载细胞与Cu2 (2.5M)而准备，洗三次等渗盐水溶液，然后在37°C恒温箱中再次恒温不同浓度的硫化物离子(40和80M)45min。洗涤后，在上述条件下的显微镜下对细胞

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