ca族和CD族半胱氨酸蛋白酶不可逆肽抑制剂的设计、合成和评价外文翻译资料

 2023-05-30 09:13:56

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ca族和CD族半胱氨酸蛋白酶不可逆肽抑制剂的设计、合成和评价

在过去，迈克尔接受者已被雇用为针对几种半胱氨酸蛋白酶45-47的弹头。其中最有效的抑制剂是乙烯基砜48和alpha;，beta;-不饱和羰基衍生物对各种半胱氨酸蛋白酶49,50。文献中报道的原始策略是用部分取代良好底物的羰基，这将捕获酶亲核试剂（Ser-OH或Cys-OH），而不改变酶识别和结合所需的结构特征。报道的第一个迈克尔受体抑制剂之一的环氧琥珀酸酯E-64c的富马酸衍生物通过beta;位44中的另外的羰基延伸alpha;，beta;-不饱和羰基。该改型允许保留可裂解的羰基在酶活性位点内可能的结构识别和结合要求。 E-64c的富马酸类似物和环氧化物母体化合物都不会抑制部分CD蛋白酶，但对于氏族CA蛋白酶非常有效。然而，E-64c环氧弹头本身可以掺入特异于除氏族CA以外的氏族的抑制剂。第4.1章已经描述了对氏族CD曼氏血吸虫天冬酰胺内肽酶legumain特异性的氮杂肽环氧化物的设计和合成。 E-64c（反式HOOC-CH = CHCOLeu-NH（CH2）2CH（CH3）2）的富马酸酯衍生物抑制组织蛋白酶B（kapp = 625M-1s-1），组织蛋白酶H（kapp11

M-1s-1）和组织蛋白酶L（kapp = 2272M-1s-1）。 alpha;，beta;-不饱和羧基部分通过活性位点亲核试剂进行迈克尔加成，因此抑制剂不可逆地结合酶。由于第4.1章中描述的氮杂肽环氧化物被证明是曼氏酵母菌的有效和选择性抑制剂，我们通过用双键取代环氧化物部分并行修饰这一特定设计以形成迈克尔受体（图4.2.1） 。在这里，我们报告了氮杂肽迈克尔受体的设计，合成和评价作为曼氏木霉的有效和特异性抑制剂，并提供了抑制机制的证据。

氮杂肽环氧化物 氮杂肽迈克尔接受者

图4.2.1。 衍生自氮杂肽基环氧化物的氮杂肽基迈克尔受体设计。

此外，我们合成了一种更好的Michael受体抑制剂的生物素化衍生物。 生物素在过去被用作蛋白酶活性的亲和标记。 通过将生物素标记附着在选择性抑制剂上，可以在生物体内定位靶酶的原位活性。 因此，对曼氏乳杆菌酵母特异性的生物素化迈克尔受体抑制剂因此将成为检测寄生虫或Legumain或其他类似豆类蛋白酶的可能前体中的豆粕活性的有用工具。

化学

氮杂 - 富马酸盐类似物的合成基于氮杂 - 肽环氧化物抑制剂的设计。 总体策略是模拟扩展的肽底物，同时保持合成容易。 用氮替代P1天冬酰胺酰基残基的alpha;-碳允许通过偶联到所需的富马酸盐衍生物或市售的丙烯酸类似物来实际延伸到P方向。 富马酸酯羰基现在位于肽酶底物的剪切肽羰基的确切位置，并且可以容易地修饰抑制剂的P位点以探索酶与抑制剂之间的S亚位点相互作用的耐受性。

通过使用NMM和iBCF的标准混合酸酐偶联，然后使用NaOH水溶液在甲醇中使乙酯脱保护，从富马酸单乙酯和相应的伯胺或仲胺开始制备一系列酰胺富马酸酯衍生物（13a-x）（图4.2.2）。 各种二取代的芳族胺由蒂凡尼·斯塔克（Stiff）和艾米·坎贝尔（Amy Campbell）通过还原性胺化合成，起始于芳族醛前体和芳族伯胺。 使用NMM和DCC作为偶联剂，由富马酸单乙酯和苄醇形成苄酯富马酸酯衍生物。 反式立体化学的选择是基于第4.1章所述的环氧化物抑制剂。 顺式环氧琥珀酸盐显示非常小的效力，因此富马酸盐类似物的设计不考虑顺式立体化学。

（i）NMM，iBCF，CH 2 Cl 2，HNR 1 R 2; （ii）1.NaOH，2.HCl，MeOH。

图4.2.2。 富马酸前体的制备。

根据我们先前报道的在4.1章中合成氮杂肽环氧化物的方法制备肽基酰肼。由Mathieu等人确定的用于legumain的最佳底物序列Cbz-Ala-Ala-Asn-AMC提供了抑制剂的肽序列的基础30。使用过量的肼在甲醇中由Cbz-Ala-Ala-OMe开始形成肽基酰肼3。通过酰肼与溴乙酸乙酯和NMM的烷基化合成天冬酰胺酰基侧链。原子氮在紧邻羰基的酰肼氮上的烷基化是基于初级氮的亲核特性。根据Hogberg等[43]所述的方法，通过用催化量的NaCN进行氨解来完成乙酯转化为酰胺（9）。然后使用HOBt和EDC将肽前体与取代的富马酸酰胺（13a-x），富马酸酯或市售的丙烯酸偶联，以完成各种富马酸酐或丙烯酸衍生物（15a-f）（图4.2.3）

对于生物素化衍生物的设计（图4.2.4），我们选择将生物素部分连接到抑制剂的非质量侧以代替Cbz保护基，以不干扰活性位点结合相互作用。我们假设生物素部分中的烷基间隔物在弹头的结构特征之间产生足够的距离，这对于抑制是必不可少的。我们选择乙酯15a（Cbz-Ala-Ala-AAsn-CH = CHCOOEt）作为最适合的衍生化抑制剂，因为它是最有效的，并且作为富马酸单乙酯前体可商购。为了合成生物素化抑制剂，我们选择用Boc保护基代替Cbz保护基团，因为Cbz脱保护需要催化氢化，这可能影响富马酸盐部分的双键。可以使用稀释条件用TFA除去Boc基团。以类似于Cbz保护的化合物的方式合成Boc-保护的氮杂 - 肽迈克尔受体。生物素与迈克尔受体抑制剂的游离N-末端的偶联提供了初步的困难，因为羧酸部分不足以与HOBt / EDC偶联。在二氯甲烷和THF中，混合酸酐偶合法失败，因为生物素在大多数有机溶剂中极不溶。我们最初决定通过将其转化为酰氯来活化生物素的羧酸部分。然而，这个功能太过于反应了。生物素N-羟基琥珀酰亚胺先前已经成功地与肽基抑制剂的N-末端连接51,52。在三乙胺存在下，将生物素N-羟基琥珀酰亚胺17与Ala-Ala-AAsn-CH = CHCOOEt（20）的TFA盐偶联，得到富含收率的生物素化的氮杂 - 肽基富马酸酯乙酯21。

图4.2.3. 富马酸和丙烯酰基前体与肽基酰肼的偶联

图4.2.4. 制备生物素化迈克尔受体抑制剂

结果与讨论

合成设计.氮杂肽的设计已经在31,34之前与legumain的抑制剂一起使用。用氮替代手性alpha;-碳改变了剪切肽键的取向。氮杂肽功能是平面的，因此限制了原始肽键的构象和旋转自由度。 Niestroj等人先前报道了氮杂 - 天冬酰胺酰氯氯甲基酮的合成31。在合成策略中出现的一个担忧是天竺葵侧链与弹头的分子内环化。然而，氮杂 - 肽主链的刚性防止了分子内环化，并使得抑制剂在侧链脱保护之后稳定。在合成进程中，天冬酰胺侧链保持不受保护，没有观察到环化。

氮杂肽设计对于在P1位上引入各种取代基也是非常实用的。富马酸盐和丙烯酸酯可以在偶联到肽前体之前被衍生化。这将使我们能够进行广泛的SAR研究来探索酶的S亚位点的耐受性。

在肽骨架中掺入氮杂部分有两种可能途径。在通过将肽甲酯转化为肽基酰肼之前，可以通过天冬酰胺侧链进行烷基化来制备酰肼。第二种方法是直接添加带有肼部分的氨基酸侧链类似物。必须考虑肼部分的反应性。取决于肼取代基，一个肼氮的反应性超过其他变化。吸电子取代基如酯或酰胺在初级肼碳上具有较高的亲核特性。给电子取代基在次氮上沉积反应性53,54。由于这些原因，我们选择在引入侧链之前将肽甲酯转化为酰肼，因为这将使我们将我们的设计扩展到除氮杂 - 天冬酰胺部分之​​外的氮杂 - 肽基类似物。我们目前正在研究氮杂肽基功能与鸟氨酸，赖氨酸和天冬氨酸类似物的应用。替代策略仅限于少数氨基酸类似物。

Legumain抑制.测试这些化合物对曼氏血吸虫的抑制效力。 IC 50值报告在表4.2.1中。 结果总体上与章节中描述的环氧化物抑制剂的总体趋势相当。4.1

表4.2.1. s . mansoni Legumain抑制与aza肽Michael受体

富马酸苄酯和乙酯（15a，15b）是最有效的抑制剂之一。 单取代的酰胺（14e，f，g）和丙烯酸酯衍生物（15d，e，f）几乎没有抑制，这导致我们得出结论：抑制剂和活性位点之间的氢键网络与羰基接触是最佳的 到双键，没有提供H键的单取代酰胺。 丙烯酸苯甲酯Cbz-Ala-Ala-AAsn-CH = CHCOPh（15c）满足上述两个要求，但令人惊讶地不抑制legumain。 我们发现芳香族富马酸酯延伸物比烷基衍生物（NEt2，N（nBu）2，Pip）降低IC 50。 我们推测，其中一个酶口袋中芳香族残基的增加的Pi;堆叠可以改善抑制剂的结合。 芳香二甲酰基衍生物14p意外地仅以900nM的IC 50进行抑制。

苯基或萘环的定位和取向起重要作用。与N-甲基苄基类似物相比，N-甲基苯基类似物（14h）的效力较低（IC50 = 60nM）（14i，IC50 = 55nM）。然而，将烷基间隔物延伸一个另外的亚甲基到N-甲基苯乙基类似物（14k），显着降低了抑制（IC50 = 600nM）。与N-甲基苄基酰胺相比，N-甲基-1-甲基萘基（14j）衍生物的延长的芳香性产生甚至更低的IC 50（35nM）。二苄基酰胺显示芳族二取代酰胺的最低IC 50（14m，IC50 = 45nM）。用电子给予甲氧基（14n）或吸电子氟（14o）取代一个苄基环只会降低效力。下一步是结合萘基与苄基取代基的作用。但是，N-苄基-2-甲基萘基（14q）和N-苄基-1-甲基萘基类似物（14r）都不能改善二苄基酰胺的IC50。在喹啉（14s），异喹啉（14t），二氢吲哚（14u）和异二氢吲哚（14v）类似物中苄基的取向和灵活性受到限制。喹啉和二氢吲哚均显示出良好的效力（IC50 = 70nM），但与苄基酰胺相比较低。二氢吲哚和喹啉二环体系中芳香环的灵活性要低得多。由于氮的位置不同，异二氢吲哚和异喹啉化合物中芳环的取向与其母体化合物不同。芳环的改变取向显着降低了它们的效力。 4-苯基四氢吡啶（14w）和氨基酸衍生物（14x）都不能提高弹头的有效性。酯通常比酰胺类似物更有效，但是它们的制备难度也限制了可能的化合物的多样性。生物素抑制剂生物素-Ala-Ala-AAsn-CH = CHCOOEt

  1. 表现出最大的效力与legumain（IC50 = 10 nM）。

稳定性研究.然而，酯衍生物的增加的反应性不仅限于酶抑制。 此外，我们观察到酯与硫代烷基化剂如DTT反应（表4.2.2）。 通过在legumain测定缓冲液中培养各种Michael受体抑制剂与DTT，我们观察到Michael受体双键随时间的消失。 发现非常有效的Cbz-AlaAla-AAsn-CH = CHCOOEt（IC 50 = 31nM）具有3.7分钟的半衰期，一级速率常数为3.10times;10 -3 s -1，当与过量 在常规测定缓冲液中，室温pH 6.8下的DTT。 酰胺取代的迈克尔受体以较慢的速率与DTT反应。 对于Cbz-Ala-AlaAAsn-CH = CHCON（Me）Bzl和Czz-Ala-AlaAAsn-CH = CHCON（Me）Bzl测定半衰期为20分钟和17分钟，一级速率常数为5.78times;10 -4 s -1和6.73times;10 -4 s -1 Cbz-Ala-Ala-AAsn-CH = CHCON（Bzl）。

表4.2.2。 在DTT存在下各种抑制剂的降解

由于吸电子性能的差异，丙烯酸酯通常比丙烯酰胺更能反应亲核攻击。 Freidig等已经发现了关于非肽基母体化合物，丙烯酸乙酯和丙烯酰胺与硫烷基化谷胱甘肽的反应性的类似结果。 他们的研究得出结论，丙烯酸乙酯与丙烯酰胺比丙烯酰胺快85倍，二级速率常数为0.66M-1s-1和7.8times;10-3M-1s-55.我们用肽基丙烯酰胺和丙烯酸酯和DTT的反应性实验结果 丙烯酸酯/丙烯酰胺的反应活性比在5和6之间。烷基取代的丙烯酸酯不显示与DTT的反应。

我们观察到Michael受体与DTT的​​反应性也取决于缓冲溶液的pH值。 DTT硫醇的pka为9.2。较高的pH导致溶液中脱质子化DTT硫醇的浓度较高，并促进双键的亲核攻击。在降解试验中降低pH会显着降低反应速率。例如，在pH6.8下与DTT的​​反应中，乙酯的半衰期为3.7分钟。将pH降至5.8会使半衰期延长至19分钟。 pH对酰胺衍生物的稳定性的影响更显着。当降低pH时，Cbz-Ala-Ala-AAsn-CH = CHCON（Me）Bzl的半衰期从20分钟增加到376分钟。在先前研究中使用胱天蛋白酶特异性四肽酰基氮杂 - 天冬氨酰基迈克尔受体，我们发现半胱氨酸蛋白酶特异性乙酯类似物在与DTT反应中的半衰期在pH 7.2下为10分钟。在相同的pH下，N-甲基苄基酰胺的半衰期为116分钟。我们怀疑抑制剂的肽的长度和侧链的空间体积的大小对降解速率有影响。因此，当评估抑制剂的效力时，必须考虑单独抑制剂与DTT在酶抑制测定的pH下的反应性。

我们确信，在DTT添加时，Legum Michael受体抑制剂的降解包括通过反应性DTT硫醇进行的Michael受体双键的硫烷基化反应，因为可以光谱监测双键的逐渐消失。 最初尚不清楚，双键的碳被烷基化了。 有两个可能的攻击点，即双键的C2或C3碳，给出两个烷基化区域异构体（图4.2.5）

图4.2.5. 含有DTT的Aza-Peptidyl Michael受体抑制剂的硫代烷基化机理。

各种Michael受体相对于不同的P1取代基（其中酯gt;酰胺gt;烷基）的反应顺序表明硫代烷基化发生在双键的C2位置。为了进一步支持DTT对我们抑制剂的区域选择性硫代烷基化，我们使用ChemDraw来预测1 H NMR光谱中两种可能产物的差异。 C2硫代烷基化的估计化学位移使新的硫醚键的质子位于4.11ppm。 C3硫代烷基化将导致3.59ppm的估计化学位移

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