高灵敏度醛类检测方法在葡萄干和牛乳粉糠醛分析中的应用外文翻译资料

 2022-01-16 19:44:27

高灵敏度醛类检测方法在葡萄干和牛乳粉糠醛分析中的应用

重点

本文首先以硝酮的形成为柱前衍生方法。

实现了荧光和质谱响应的显著信号增强。

检测限低至0.1nm。

为食品样品中糠醛的高灵敏度检测提供了工具。

文章信息

文章历史：

收到日期：2017年6月19日

于2017年8月13日收到修订版

接受日期：2017年8月17日

2017年8月26日在线发布

图形摘要

摘要

首次采用基于硝酮的形成的柱前荧光衍生法测定食品样品中的糠醛（如糠醛（F）、5-甲基糠醛（5-MF）和5-羟甲基糠醛（5-HMF））。采用N-取代羟胺试剂4-（（羟基氨基）丁基）-7-羟基香豆素（HAHC）与糠醛醛基反应，形成稳定的高荧光强度的硝酮衍生物。反应在温和条件下进行30分钟，衍生化率高（gt;93%）。随后在25分钟内，在反相柱上实现了三种糠醛衍生物的基线分离。检测限为股骨低水平（S/N = 320mu;L/次注射）。校准曲线的线性范围为0.4 - 4000纳米，相关系数良好（R2ge;0.9991）。该方法可以进一步应用于牛乳粉、葡萄干等食品样品的分析，得到在94.7%-103.5%的的回收率。综上所述，这种柱前衍生方法简单、快速、灵敏度高，为今后不同基质中醛的研究提供了一种有效而有前景的方法。

1.介绍

糠醛，包括糠醛（F）、5-甲基糠醛（5-MF）和5-羟甲基糠醛（5-HMF），作为一组重要的呋喃醛，可以在各种食品中发现，例如牛奶[1,2]、葡萄干[3,4]、面包[5]、浓缩果汁[6]、蜂蜜[7]、醋[8]和葡萄酒[9,10]等。它们是由糖[11]因热处理或长储存时间而降解而产生的[3,9]。糠醛的存在会导致这些食品的颜色、质地和风味发生变化[12,13]。此外，一些研究指出，F、5-MF和5-HMF可能具有诱变作用和基因毒性作用[14,15]。当这些化合物的浓度超过人体吸收的一定限度时，这些化合物会对人体中枢神经系统，肝脏，肾脏，心脏和其他器官产生负面影响[16]。因此，开发一种简单，快速和灵敏的方法来确定不同食品中糠醛的存在至关重要。

分光光度法[17-19]和色谱法（例如气相色谱法（GC）[10,20-22]和高效液相色谱法（HPLC））[23-26]等方法已经开发出来了。一方面，分光光度法更简单，成本更低，但它们往往受到基质效应和选择性不足的阻碍。另一方面，采用紫外线检测（LC-UV）的液相色谱法已应用于食品中糠醛的测定，但其检出限通常比GC与质谱法相比高出2-3个数量级（GC-MS），GC-MS通常需要几个分析步骤，包括分析前的提取和衍生化[21,27]。

与MS或荧光检测（FLD）结合的HPLC方法具有高灵敏度和选择性，并且它们通常用于给定基质中的有效分析。广泛用于增强分析物的疏水性和光谱响应，荧光衍生化也已用于HPLC-FLD测定糠醛。例如，Donnarumma等人[25]报道了使用荧光丹磺酰肼（DNSH）标记测定人血浆中的5-HMF，并在皮摩尔水平实现了低检测限（LOD）。

我们的实验室最近合成了一种醛反应剂，4-（（羟基氨基）丁基）-7-羟基香豆素（HAHC）[28]。该试剂显示出良好的荧光性质，具有0.61的高量子产率。在HAHC中，香豆素作为荧光团核心，N-单取代羟胺基团作为反应性末端（图1）。因此可以通过与HAHC的缩合反应来标记呋喃醛，得到没有异构形式的硝酮衍生物（图2）。此外，长脂族碳链也有望增加衍生物的疏水性并改善其色谱行为[29]。

这项工作的目的是使用HAHC作为衍生化试剂实现硝酮形成方法，该方法使用HPLC-FLD对食品中的糠醛进行定性和定量分析。在温和条件下优化了几个反应参数实现高衍生化产率。此外，还在荧光和质谱检测中研究了用HAHC标记的糠醛的信号增强。最后，通过分析干葡萄干和牛奶粉样品中的糠醛来验证该方法。相信这种使用N-取代羟胺试剂的衍生化方法在各种来源的醛的敏感分析中具有很大的潜力。

2.实验

2.1.原料和化学品

4-（（羟基氨基）丁基）7-羟基香豆素（HAHC）在实验室合成。5-羟甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛和丹酰肼购自Jamp;K科学公司（中国北京）。脂肪醛C1-C6，包括甲醛（C1）、乙醛（C2）、丙醛（C3）、丁醛（C4）、戊醛（C5）、己醛（C6），购自阿拉丁（中国上海）。乙酸、乙酸钠、乙酸铵、磷酸、磷酸二氢钾、三氟乙酸和苯胺购自中国上海国药化学试剂有限公司。葡萄干购自天宇食品有限公司（中国安徽）。牛乳粉购自蒙牛乳业有限公司（中国内蒙古）。除另有说明外，本研究所用试剂均为分析试剂级。过滤器（N66，13mmtimes;0.22mm）购自津腾（中国天津）。超离心管（再生纤维素，5Kmwco）购自Milliporeamicon（美国马萨诸塞州）。

2.2.设备和试剂

在岛津LC-20A系统上进行色谱分析，该系统带有一个带有20mu;L样品环的注射器、一个岛津RF-20荧光检测器和一个色谱数据采集软件。在反相高效液相色谱柱（安捷伦Eclipse xdb-c18，5mu;m，4.6times;150mm）上进行分离。液相色谱法乙腈（ACN）购自费希尔科学公司（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）。水的质量等级为千分之一。荧光光谱记录在RF5301荧光光谱仪（日本东京岛津）上，并在具有1times;1cm石英池的Lambda 10紫外/可见光谱仪（Perkin-Elmer公司）上记录紫外/可见光谱。使用pH计（美国萨托利斯市PB-10）测定pH值。

2.3.纳升电喷雾质谱分析

在三重TOF 5600系统（美国ab-sciex）上用纳米喷雾源测量了电喷雾电离质谱（ESI-MS）。样品分离的洗脱模式是在带有C18（5mu;m，0.15times;150mm）柱的Nanolc超系统（Eksigent，美国）上进行的。柱温保持在25℃。用溶剂A和B进行洗脱，溶剂A和B分别是乙腈-水（0.5/9.5，v/v）和含0.1%甲酸的乙腈-水（9.5/0.5，v/v）。用25mu;L溶剂A和25mu;L甲醇溶液溶解样品。将溶液中的2.4mu;L等分试样的溶液以2.0mu;L min-1的速率装入捕获柱中10分钟，用300nL min-1的梯度洗脱进行分析分离，用3 psi的离子源气体、35 psi的幕气、2.3kV的离子喷涂电压获得数据采集，接口加热器温度为150℃。ESI-MS是在20-2000 m/z质量范围内的正离子模式下进行。IDA（信息相关采集）模式用于扫描电荷数从1到4的20个最丰富的前体离子。使用PeakView 1.2软件（AB SCIEX，USA）处理得到的数据。

2.4.荧光分析

将HAHC溶于乙腈水（1.0/9.0，v/v）中，浓度为2mM。对于发射光谱，激发波长保持在322nm，发射波长从350nm扫描到600nm。对于激发光谱，发射波长保持在447nm，激发波长为200-400nm。

2.5.衍生化程序

在标准衍生程序中，将20mu;L的HAHC溶液（1mM）、10mu;L的标准糠醛溶液、10mu;L的苯胺溶液（20mM）和10mu;L的乙酸钠缓冲液（0.1M，pH3.5）混合在塑料离心管中。将混合物置于室温（20℃）下30分钟，然后用高效液相色谱法进行荧光检测（HPLC-FLD）分析。除添加标准糠醛外，试剂空白进行相同的程序。

2.6.色谱分离

通过HPLC系统使用C18柱以1mLmin-1的流速分析样品，在荧光激发和发射波长分别为322和447nm处进行荧光检测。在分析之前，将C18柱用流动相预平衡30分钟。注入20mu;L等份的制备的测试溶液。柱温保持在30℃。洗脱后进行二元梯度分离。洗脱液A是乙腈-水（0.5/9.5，v/v），洗脱液B是乙腈。梯度：0-12分钟，13％B;12-30分钟，20％B。

2.7.HAHC和DNSH标记后色谱图的比较

DNSH标记：三种糠醛的衍生化程序根据参考文献[25]采用DNSH。注射三种糠醛的浓度各为0.02mM。如参考文献[25]所述进行色谱分离。荧光检测器的激发和荧光发射波长分别设定在350和525nm。分离遵循二元梯度模式。洗脱液A是磷酸盐缓冲液（20mM，pH2.5），洗脱液B是乙腈。梯度：0-4分钟，30％B; 4-9分钟，30％B至60％B。流速保持在1mL min-1，柱温保持在30℃。

HAHC标记：三个糠醛的衍生化程序在2.5节中描述。三种糠醛的注射浓度各为0.02mM。色谱分离在2.6节中描述。

2.8.方法验证

通过分析从LOQ（信噪比=10）值到4mu;M的不同浓度的三种糠醛的标准混合物来计算线性。通过在同一天的六个重复的标准糠醛样品测量日内精确度，并且通过在三个不同的日子使用相同的方法确定日间精密度。通过在样品制备程序之前分析中浓度和高浓度（0.4mu;M和1mu;M）的加标样品来确定回收率。比较加标样品的计算和预期浓度（C），使用以下等式确定回收率值：回收率％ = [C spiked样品/C expected]times;100。

2.9.样品制备

葡萄干：干葡萄干的样品制备根据参考文献[4]进行，具有轻微的改性。简而言之，在50mL离心管中精确称量5.0g样品。然后将5mL甲醇和20mL 0.02M乙酸铵溶液（用乙酸预调节至pH = 4.5）加入该离心管中并超声混合30分钟。将混合物的上清液通过0.22mu;m过滤器（尼龙66）过滤，并在衍生化之前转移到新的塑料离心管中。在衍生化之前将样品稀释10倍。

奶粉：样品预处理按照前面描述的程序[30]稍作修改。简单地称量5.0g样品，并用温水溶解至25mL。将溶液充分混合超声处理10分钟。然后向溶液中加入1mL乙酸-水（2.5/7.5，v/v），然后加入甲醇至50mL的体积。将混合物充分混合，然后在截留分子量为5000Da的超滤管（再生纤维素膜）中以600rpm离心2小时。然后将滤液通过0.22mm过滤器过滤并转移到新的塑料离心管中。在衍生化之前将样品稀释2.5倍。

3.结果和讨论

3.1.用HAHC衍生

HAHC是作者合成的一种新型荧光试剂，其合成方法和性质在我们之前的工作[28]中有过描述。HAHC的荧光激发和发射波长分别为322和447nm（图3），在我们的初步尝试中，我们选择了F作为模型呋喃醛，在50℃下与HAHC反应1h，然后进行了高效液相色谱-荧光光谱分析。与对照组相比，在高效液相色谱谱中观察到一个新的峰（Tr = 9min），并确定为F-HAHC衍生物（见图4A）。然后收集与该峰对应的洗脱液并进行荧光和ESI-MS检测。由此得到的荧光光谱（图S1）表明F-HAHC衍生物和HAHC具有相同的性质lambda;ex和lambda;em，表示F-HAHC衍生物的荧光由HAHC部分决定。

ESI-MS检测到m/z = 328.12的离子（图4B），与理论m/z值为328.1182的F-HAHC衍生物相对应。此外，对ESI-MS/MS光谱仔细观察，发现F-HAHC衍生物离子可以在碳氮键和靠近呋喃的碳氮双键上断裂（图5）。主碎片离子（m/z = 217.09）属于HAHC部分，次突出离子（m/z = 81.03）属于糠醛部分。

简而言之，这些结果表明糠醛被HAHC成功地标记，产生了一个单一的F-HAHC硝基衍生物。这一观察结果与先前研究的结果一致[31,32]，作者表明，醛与N-单取代羟胺的缩合反应产生了一个没有异构体的硝基产物。请注意，标记试剂，如2,4-二硝基苯肼（DNPH）[26]、DNSH[25]和O-（2,3,4,5,6-五氟苯甲酰）羟胺盐酸盐（PFBHA）[27]，它们的衍生物可以同时存在于E-和Z-异构体形式，为每种糠醛提供两个峰。相反，我们的衍生方法只产生一个明确的异构体，这简化了色谱图，并有助于糠醛混合物的分析。

3.2．衍生条件的优化

接下来，我们使用单因素分析来研究影响衍生效率的各种参数，包括反应时间、反应温度、酸碱度和衍生试剂量。结果如图6所示。我们利用高效液相色谱谱中的产物峰面积来估计衍生效率。峰面积越大，衍生效率越高。

在50℃水浴中通过对反应时间的监测，研究了反应时间对反应的影响。如图6A所示，反应时间4h时糠醛衍生物的峰面积趋于稳定，因此确定4h为最佳反应时间。

在25℃-70℃范围内考察了反应温度。如图6B所示，衍生物的峰面积在50℃时最大。当反应温度超过50℃时，衍生物的峰面积减小，这可能是由于硝酮衍生物在较高温度下的不稳定性。50℃为最佳反应温度。

由于醛和羟胺在酸性条件下易于缩合[33]，因此在3.0-5.0的pH范围内使用乙酸钠缓冲液对衍生化反应进行了进一步优化（图6C）。在pH3.5时峰面积最大，该值被确定为最佳pH值。

通常，在荧光衍生化中，需要过量的标记试剂来确保衍生化的效率和再现性。然而，过量的试剂可能导致液相色谱柱过载和色谱峰拖尾，因此需要选择合适的试剂量。如图6D所示，增加HAHC浓度最初导致峰面积增加。然而，当HAHC浓度达到0.4mM及以上时，峰面积几乎保持不变。因此，在派生过程中，选择0.4mM作为优化的HAHC浓度。

这些结果表明，在50℃下进行4h的衍生化反应具有最高的衍生化效率，而在85℃加热时，5-HMF在果汁[34]中能在几秒钟内形成，表明在实际样品分析中应避免高温，特别是在含糖食品中。因此，为了在相对较低的温度下补偿良好的衍生效率，需要选择合

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资料编号：[1257]

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