采用液相色谱-质谱联用检测筛选中国芒映射族中的潜在副产物外文翻译资料

 2022-01-30 22:14:14

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采用液相色谱-质谱联用检测筛选中国芒映射族中的潜在副产物

Ifat Parveen a,*, Thomas Wilson a,*, Michael

D. Threadgill b, Jakob Luyten c, Ruth E. Robertsa, Paul R.H. Robson a, Iain S. Donnison a

, Barbara Hauck a, Ana L. Winters a

阿伯里斯特威斯大学生物，环境与农村科学研究所Gogerddan，

Aberystwyth，Ceredigion SY23 3EB，英国

  1. 巴斯大学药学与药理学系药物化学，

Claverton Down，Bath BA2 7AY，UK

  1. KH Kempen大学学院，保健与化学系，

Kleinhoefstraat 4,2440 Geel，比利时

摘 要

社会要求更多来自可持续来源的绿色化学品。芒草通过发酵是平台化学品和生物乙醇的潜在来源。已发现芒草（Miscanthus sinensis）含有特别高水平的可溶性酚（羟基肉桂酸酯和类黄酮），其可用于营养保健品，化妆品和制药工业。在这里，我们描述了关于从双亲中国芒映射族的叶组织中鉴定和定量酚类的第一项研究。亲本和后代显示出具有高度相关结构的酚类的复杂谱，这使得个体表型的表征复杂化。通过反相液相色谱分离半纯化提取物，结合二极管阵列和ESI-MS / MS检测，能够区分不同的酚类谱。十个羟基肉桂酸酯（O-肉桂酰基奎尼酸）和几种黄酮（一种单-O-糖基黄酮，八种单-C-糖基黄酮，两种二-C-糖基黄酮，五种O-糖基-C-糖基黄酮和9种2//-O-糖基-C-糖基黄酮）在种子阶段，在200个子代和母本植物和父本植物的叶组织中鉴定和定量了-O-糖基-C-糖基黄酮）。选择表现出高，中等和低量羟基肉桂酸酯和类黄酮及亲本的子代，并在生长7个月时筛选以确定这些酚在其最高生物量下的丰度并与幼苗比较。随着叶子成熟，酚类的浓度通常会降低。鉴定了几种黄酮糖苷。该技术可用于快速筛选映射族中的植物，以鉴定具有高苯酚含量的基因型，从而在生物精炼链中增加价值。该比较研究提供了来自易于再生资源的潜在有价值化合物含量的信息，以及可用于育种计划中鉴定的生物标记物。

1.简介

社会越来越关注化学工业对环境的负面影响，这导致需要从可持续来源供应“绿色”化学品。在能源作物中鉴定高价值化学品将提高生物炼油链的价值，从而增加生物能源的采用并减少对化石燃料的依赖。使用基于植物的原料的生物精炼厂可以生成多种产品，包括平台化学品，燃料和动力（Cherubini，2010）。清洁加工技术的进步，特别是在发酵，分子中和基因工程，越来越多地允许化学工业使用基于植物的化学工业，而不是石化，用于制造商业上重要的化学品的原料（Xu et al。，2008）。 绿色化学品不仅限于燃料行业，还涉及一系列商业领域，包括制药，营养品，化妆品，食品和饮料行业（Dong等，2011; Crozier等，2009; An等。，2008; Aburjai和Natsheh，2003）。据估计，每年世界生物量的产量超过11014 kg（Xu et al。，2008）。仅在美国，每年生产的2.5* 1011 kg植物生物质被浪费，超过目前用于生产有机化学品，塑料树脂和纤维的总消耗量11 kg（Xu et al。 ，2008）。此外，目前只有5％的化学品来自可再生资源，生物化学品可能与基于石油化工的同行共享市场（Xu et al。，2008）。

人们对使用多年生草（例如芒草（Miscanthus spp））非常感兴趣。并且Panicum virgatum，作为可再生生物质的来源（Lewandowski等，2000）。生物质的组分，如木质素，纤维素和半纤维素（Kleinert和Barth，2008），用于以热，电和液体燃料的形式提供生物能源（Cherubini，2010）。在草中存在许多具有潜在商业价值的其他化学品（Heaton等，2008）。由于其高木质纤维素产量，芒草是生物精炼生物质的良好来源，在低温（3 104 kg公顷-1）产生的可收获生物量几乎是P. virgatum（110）4 的三倍多。千克公顷-1）（Heaton等，2008）。此外，芒草能够容忍边缘土地和洪水（Heaton等，2008; Lewandowski等，2000）。来自芒草的生物质具有高木质素含量，占细胞壁的约24-25％，使其更接近木质材料而不是草（Lygin等，2011; Villaverde等，2010）。此外，羟基肉桂酸（特别是阿魏酸和对香豆酸）共价连接到草种的细胞壁中，在那里它们通过酯键和醚键交联半纤维素和木质素，并且它们的浓度被认为与之相关。易于水解生物质（Akin，2007）。

植物产生多种单酚和多酚，具有增强细胞壁，紫外线防护，抗逆性和抗病原体的作用（Parveen等，2010,2011）。这些包括羟基肉桂酸缀合物和来自苯丙烷类和莽草酸途径的类黄酮，并具有抗氧化和紫外线吸收性质。从作物中鉴定商业上重要的分子以使生物精炼厂内的价值最大化，导致需要用于生物化学品的提取，鉴定和定量的高通量筛选工具。高效液相色谱（HPLC）是最广泛使用的分析技术，用于表征各种多酚化合物。LC-电喷雾电离 - 串联质谱（LC-ESI-MS / MS）已被用于在多种植物中快速表征和定量羟基肉桂酸结合物和类黄酮（Parveen等，2011; Valls等，2009） ; Clifford等，2006）。

芒草目前正在作为生物燃料被工厂进行调查，然而，在这种多年生草中鉴定高价值化学品的工作很少。通过将具有对比表型的父母与所选性状杂交来产生作图家族。然后筛选后代的性状变异（分离），然后可以与基因组序列中的后代之间的差异相关联。这项研究的总体目标是筛选映射族，以确定商业上重要的化学品，这些化学品可以提高生物精炼链的价值，并确定显示这些化合物丰度最高的基因型和生长阶段。实例是木犀草素及其糖苷，据报道它们具有抗黑素生成活性（An等，2008），自由基清除活性，抗炎活性（Odontuya等，2005）和抗菌活性（Dillard和德国， 2000）。

个体后代的表征由于酚的复杂分布和高丰度的相关结构而变得复杂，并且目的是确定LC-PDA-ESIMS / MS用于检测作图家族内的变异的应用。在早期发育生长期（一个月的生长期）和七个月生长期间的最高生物量，研究双亲芒草（Miscanthus sinensis）映射族（两百个后代以及母系和父系植物）的叶组织中的可溶性酚谱，我们讨论了可用于开发此类化学品遗传筛选的高价值化学品的变异。

2.结果和讨论

由于其高表型变异性，选择由双亲杂交组成的中国芒（M. sinensis）映射族用于研究。母本植物表现出保持绿色性状，而父本植物产生高生物量和高数量的种子。以负离子模式的LC-DAD-ESI-MS / MS用于在早期发育生长（一个月幼苗）中筛选200个后代和母本和父本植物的可溶性酚。在后代和双亲的叶组织中鉴定和定量超过30种羟基肉桂酸酯和类黄酮（图1）。该方法被证明对于区分后代之间的酚类分布的差异是有效的。根据羟基肉桂酸酯和类黄酮的含量将后代分为（低，中和高）类别（图2）。选择11个具有高，中，低浓度羟基肉桂酸酯和类黄酮及两个亲本的后代，并在生长7个月时进行筛选，以确定这些可溶性酚在生物量生产高峰期的丰度，并将其水平与酚类物质进行比较。当幼苗。关于叶组织内酚类物质在早期和晚期生长期间如何不同的信息可以提供对生物精炼链中如何增加价值的见解。基于重量/重量的羟基肉桂酸酯与类黄酮的比率在幼苗（73:60）中较高，在成熟叶中较低（12:18）。已知酚在细胞质和叶绿体中合成，并且随着植物成熟，酚在细胞液泡中积聚或聚合成木质素以加强次生细胞壁（Kefeli等，2003）。结果表明，后代的变异显着幼苗和成熟叶中羟基肉桂酸结合物，类黄酮和总酚的浓度（图3）。通常，随着叶子成熟，酚的水平降低。这并不奇怪，因为幼苗仅含有原代细胞壁，并且随着次生细胞壁在成熟组织中变厚，可溶性酚被掺入木质素中（Kefeli等，2003）。这也与马丁一致，后者研究了多年生黑麦草成熟阶段对酚类化合物的影响，发现草本植物成熟度的增加与叶片组织中可溶性酚类比例的下降和木质素的增加呈线性相关。牧草的内容（Martin，1970）。从一个月到七个月的生长中观察到总酚浓度显着降低，最丰富的样品从8.0mg / g FW降至0.1mg / g FW。植物合成酚作为对食草动物，微生物病原体，无脊椎动物害虫和恶劣环境胁迫的保护机制（Parveen等，2010）。迄今为止，关于叶子成熟对多酚浓度影响的研究很少。尽管父本植物的酚类总含量从5.3 mg / g FW降至2.1 mg / g FW，母体植物从1.6 mg / g FW降至1.1mg / g FW，这可能表明，与幼苗期相比，生长7个月后，亲本酚类总含量的差异较小，并且可能表明可溶性植物酚类在前几个阶段可能迅速丧失。几周的发展。有趣的是，约。百分之二十五的后代具有类似于父系亲本的酚类，而百分之七十五显示出与母本亲本相似的特征。该群体代表双亲杂交的F1后代，并且3：1比率可以表明化学组成以经典孟德尔方式遗传，并且父本表型与参与该性状表达的基因的隐性等位基因相关联。如果化学表型也与简单的孟德尔标记分离相关，那么它将允许遗传标记的强烈关联。

图1.中国芒（Miscanthus sinensis）成熟父系（a）和母系（b）叶组织的叶组织中的HPLC色谱图（240-400nm）

(a)

3-5

29-30

24-25

16

26

17

27-

28

32

22

9-10 14

31

1

12

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21 23

18

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2

6 7-8

(b)

16

17

30

3-5

23

21

11

7

12-13

15

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18

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1

10

27

36

37

2

6

具有化学表型，并使用标记辅助选择快速选择化学特征。由于植物酚具有如此高的经济意义，可以在中国芒映射族中进一步研究，以确保实现生物精炼过程中的最大价值。另一方面，来自光谱下端的植物可能有利于发酵（Akin，2007）。值得对单个酚进行表征以评估其潜在的经济价值，因为这可以为生物精炼链增加价值，并且还可以促进转化为其他工业上有用的产品。

通过在240-340nm区域中的UV吸收鉴定出10个羟基肉桂酸酯，而通过其在240-380nm区域中的特征UV吸收谱鉴定了26种黄酮。某些化合物无法记录紫外吸收最大值，原因是丰度较低或者因共洗脱峰而被掩盖。所采用的鉴定方法使用UV吸收曲线，结合使用LC-ESI-MSn在串联质谱中观察到的碎裂模式。在可能的情况下，将酚的质谱和保留时间与标准物质进行比较，包括咖啡酸，对香豆酸，阿魏酸，5-咖啡酰奎宁酸（5-CQA，也称为绿原酸（IUPAC异构体编号）惯例（IUPAC委员会，Nomenclature，1976; Clifford等，2003）用于本文的酰化奎尼酸）），木犀草素-6-C-葡萄糖苷（异or草素），木犀草素-8-C-葡萄糖苷（orientin），木犀草素-7-O-葡萄糖苷，芹菜素-6-C-葡糖苷（异牡荆素），芹菜素-8-C-葡糖苷（异牡荆素），芹菜素-7-O-葡糖苷。

2.1 羟基肉桂酸盐

许多羟基肉桂酸结合物，包括O-咖啡酰奎宁酸，3-咖啡酰奎宁酸（3-CQA; 1），4-咖啡酰奎宁酸（4-CQA; 4）和5-咖啡酰奎宁酸（5-CQA; 3），O -feruloylquinic酸，3-阿魏酰奎宁酸（3-FQA; 2），4-阿魏酰奎宁酸（4-FQA; 11）和5-阿魏酰奎宁酸（5-FQA; 10）和O-对 - 香豆酰奎宁酸，5-对在亲本和后代的叶提取物中鉴定出了 - 香豆酰奎宁酸（5-对 - 辅酶QA; 7）（表1）。

负离子模式ESI-MSn 中咖啡酰奎宁酸的诊断碎裂离子涉及两种途径之一：酰基的缺失 - 羰基 - 氧键的断裂（其产生quinate m / z 191）和b-消除羧酸（得到脱水的quinate m / z 173和咖啡酸m / z 179阴离子）（Parveen等，2011）。对于5-CQA，在m / z 353处的MS2 实验产生碱离子m / z 191，而3-CQA的主要片段化产生MS2 碱离子m / z 191和强烈的咖啡因。酸衍生离子m / z 179（表1）。4-CQA的特征在于b-消除咖啡酸，得到MS2 碱离子m / z 173. 3-FQA的特征在于其MS2 碱离子m / z 193 [阿魏酸]-，而通过来自b-

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