英语原文共 7 页
HPLC-DAD-MSn法测定手掌根茎的化学指纹图谱
Min Cai a,c, Yan Zhoua, Suolang Gesang b, Ciren Bianba b, Li-Sheng Ding a,lowast;
a中国科学院成都生物研究所，四川成都610041
b西藏自治区药品检验所，拉萨850000，中国
c湖北大学生命科学学院，武汉430062
摘要：
首次开发了一种高效液相色谱 - 二极管阵列检测 - 串联质谱（HPLC-DAD-MSn）方法，用于对Gymnadenia conopsea R. Br。的根茎进行化学指纹图谱分析。并快速识别指纹中的主要化合物。将紫外和质谱与参考化合物的光谱进行比较，指纹中的七个主峰被鉴定为腺苷（1），4-羟基苄醇（2），4-羟基苄基醛（3），二酰基乙酰基B（4），loroglossin（ 5），dactylorhin A（6）和militarine（7）。化合物4-7是琥珀酸衍生物酯，并且首先从该物种中发现。采用中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价系统（CASES） 评价10种根茎样品的相似性从四川，青海和河北省，西藏自治区和尼泊尔收集的G. conopsea。来自不同来源的这些样品具有相似的化学指纹。这种方法具体，可以用于这种传统西藏疗法的质量鉴定和综合评估。
1.介绍
Gymnadenia conopsea R. Br。是一种在中国和尼泊尔广泛种植的兰花。它的根茎被称为“旺拉”，长期以来被用作治疗咳嗽和哮喘的传统西藏疗法，并作为中国民间医学的补品[1-3]。以前的研究表明，它具有抗乙型肝炎，清除自由基的作用[4,5]，该植物的主要成分是酚类化合物和腺苷[6-8]。然而，没有建立HPLC方法来分析这种草药。色谱指纹图谱技术是鉴别草药样品或其产品的有效方法，因此被广泛用于研究中药（TCM）[9-12]。此外，高效液相色谱 - 二极管阵列检测 - 串联质谱（HPLC-DAD-MSn）已发展成为可用于分析TCM的最强大的分析技术之一。使用在线组合技术，可以同时获得分离成分的UV光谱和串联质谱，并且将光谱与参考化合物的光谱进行比较，可以鉴定这些成分。
在本文中，使用HPLC-DAD-MSn技术，建立了一种可行且可靠的G. conopsea根茎指纹图谱，并将七个“特征峰”快速鉴定为腺苷（1），4-羟基苄醇（2），分别为4-羟基苄基醛（3），dactylorhin B（4），loroglossin（5），dactylorhin A（6）和militarine（7）。其中，琥珀酸衍生物酯（4-7，图1），
图1.化合物dactylorhin B（4），loroglossin（5），dactylorhin A（6）和militarine（7）的结构。
据报道有利于治疗痴呆，首先从该物种中发现[8]。计算机辅助相似性评价系统（CASES），用于中药色谱指纹图谱，化学计量学计算机软件，由药学工程研究所（浙江大学，中国杭州）最近开发，并得到中华人民共和国国家药典委员会的认可。中国用于中草药色谱指纹图谱的相似性研究[9,10,13,14]也被应用于本研究。该软件用于同步色谱峰并计算不同色谱图之间矢量角的余弦值，以及计算平均色谱图作为一组色谱图的代表性标准指纹/色谱图。余弦值越接近1，两个色谱图越相似。此外，计算与参考峰相关的每个特征峰的相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA），用于草药色谱图中化学组分的定量表达。本文所生成的数据为指纹分析在G. conopsea综合评价中的应用提供了有价值的见解。
2试验
2.1仪器和色谱条件
使用由真空脱气机，四元泵，自动进样器和DAD检测器（Thermo Separation Products Inc.，Riviera Beach FL，USA）组成的TSP HPLC系统来获取色谱图和UV光谱。对于色谱分析，使用具有合适保护柱（C18，ODS，5mu;m，4mmtimes;3.0mm）的Inertsil C18 ODS-3柱（5mu;m，250mm，4.6mm）。在室温下使用线性梯度（20 ◦C）和0.7ml / min的流速进行HPLC分离。用混合物（甲醇：水20：80，v / v）开始梯度洗脱，并在60分钟内将甲醇含量增加至100％。注射体积为20mu;l。将DAD检测器设定为从200nm扫描到800nm，并且使用270nm作为指纹分析的检测波长。
times;
times;
ThermoQuest Finnigan LCQ十进制系统配备了一个
电喷雾电离源（ThermoQuest LC / MS Division，San Jose，CA，USA）用于质谱测量。在正离子和负离子模式下获得ESI MSn光谱。质谱检测器（MSD）参数如下：雾化器鞘气，N2 （80 uit）;雾化器辅助气体，N2 （20 uit）;毛细管温度，350 ◦C;喷涂电压，负离子ESI模式下为4500 V，
正离子ESI模式下为5000 V;毛细管电压，13 V in（）ESI，25 V in（ ）ESI;透镜电压，18 V in（）ESI，16 V in（ ）ESI;MSn实验的分离宽度，1.0 m / z;碰撞气体，何;和碰撞能量，35％。通过使用Tee union以3mu;l/ min的速率将25％三乙胺从注射泵引入LC的柱流出物中，与分离的成分混合，然后使其进入MSD以帮助分离的成分电离。所有数据均由Finnigan XcaliburTm值核心数据系统Rev.1.2（ThermoQuest Corporation，San Jose，CA，USA）处理。
2.2溶剂和化学品
minus; minus; minus;
minus;
HPLC级甲醇（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）和从Milli-Q水系统（Millipore Corp.，Bedford，MA，USA）获得的去离子水用于制备流动相。所有溶剂均通过超声波和在线脱气系统脱气。分析级三乙胺（Bodi Chemical Engineering Corporation，Tianjin，China）用于帮助分离的成分电离。使用分析级甲醇（Yili Chemicals Corporation，Beijing，China）进行样品制备。
2.3参考化合物
在我们的实验室中，从G.conopsea的干燥根茎中分离化合物1-7。通过HR-ESIMS，NMR光谱证据鉴定这些化合物。化合物4-7的 1H NMR和 13C NMR光谱数据示于表1和表2。
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表格1 1化合物4-7的1 H NMR光谱数据 |
表2 13化合物4-7的13 C NMR光谱数据 |
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数 4 5 |
6 |
7 |
数 4 5 |
6 |
7 |
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HA-3 4.48s 4.26s |
2.99d (17.7) |
2.57d (15.3) |
C-1 172.4s 173.5s |
172.6s |
174.6s |
|
|
HB-3 |
3.11d (17.7) |
2.90d (15.3) |
C-2 84.7s 79.9s |
79.9s |
75.2s |
|
|
HA-5 1.69m 1.57m |
1.70m |
1.57m |
C-3 74.4d 76.6d |
42.0t |
44.8t |
|
|
HB-5 2.11m 1.77m |
1.74m |
1.70m |
C-4 170.7 s 171.4s |
170.3s |
170.2s |
|
|
H-6 1.73m 1.57m |
1.73m |
1.58vm |
C-5 45.4t 44.4t |
46.7t |
48.0t |
|
|
H3-7 0.91d (6) 0.72d (6) |
0.75d (6) |
0.79d (6.6) |
C-6 23.5d 23.9d |
23.6d |
23.7d |
|
|
H3-8 0.76d (6) 0.85d (6) |
0.85d (6) |
0.91d (6.6) |
C-7 23.3q 23.9q |
23.8q |
23.3q |
|
|
1-O-（4-beta;-D-吡喃葡萄糖氧基）苄基部分 |
C-8 22.7q 24.7q |
24.8q |
24.7q |
|||
|
HA-7j 4.93d (11.9) 4.82d (12.3) HB-7j 5.10d (11.8) 4.90d (12.4) |
4.92d (12.0) 5.12d (11.9) |
4.95d (11.9) 5.02d (11.9) |
1-O-（4-beta;-D-吡喃葡萄糖氧基）苄基部分C-7j 67.1t 66.4t |
66.7t |
66.3t |
|
|
H-2j,6 7.28d (9.2) 7.21d (8.4) |
7.25d (8.7) |
7.25d (8.4) |
C-1j 128.9(s) 129.3s |
129.4s |
129.5s |
|
|
H-3j,5j 7.10d (8.1) 7.01d (8.4) |
7.03d (8.4) |
7.06d (8.4) |
C-2j,6j 130.1(d) 130.1d |
130.3d |
129.9d |
|
|
Glc-1 4.89d (7.4) 4.86d (7.3) |
4.86d (7.5) |
4.86d (7.2) |
C-3j,5j 116.6d 116.6d |
116.6d |
116.4d |
|
|
Glc-2 3.46m 3.23m |
3.24m |
3.26m |
C-4j 158.0s 157.8s |
157.5s |
157.7s |
|
|
Glc-3 3.46m 3.27m |
3.23m |
3.32m |
Glc-1 100.9d 100.8d |
100.8d |
100.9d |
|
|
Glc-4 3.39m 3.17m lt;/ |
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