采用串联偶联反相 – 亲水作用色谱 – 串联质谱法同时测定肉苁蓉中极性和含量范围广的成分外文翻译资料

 2021-11-15 21:09:34

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采用串联偶联反相 - 亲水作用色谱 - 串联质谱法同时测定肉苁蓉中极性和含量范围广的成分

摘要：为了满足植物生理学家和药理学家的需求，来自世界各地的分析化学家正致力于寻找能够同时监测原发性和次级代谢产物的方法。目前的关键技术瓶颈在于为具有良好含量范围的亲水和疏水物质提供令人满意的色谱和光谱性能。在此，反相液相色谱法直接与亲水作用色谱法（即RPLC-HILIC）偶联以整合它们的优点，而稀释泵用于解决它们之间的流动相的错配。另一方面，较低的参数而不是最佳的参数适用于那些丰富的成分，以提高定量的上限，如松果菊苷（1250.0mu;g/ mL），甘露醇（100.0mu;g/ mL）和acteoside（125mu;g/毫升），在质谱仪领域。作为沙漠寄生植物以及滋补品，肉C蓉（CT）引起了植物生理学家和药理学家对其定量代谢组的广泛兴趣。同时测定覆盖CT中大多数化学家族的23种丰富和次要成分，即氨基酸，核苷，有机酸，苯乙醇苷，木脂素和环烯醚萜，试图了解原料的生理模式和药理学价值。虽然分析物的宽极性范围（-3.326le;cLogPle;1.421）和含量（超过5个数量级）范围，但所有分析物都获得了令人满意的色谱和光谱行为。通过各种方法验证测定证明了可靠的定量，例如回收率，线性，灵敏度和精确度。在20批CT中量化了23种亲水和疏水物质的含量。这些组分的含量发生了显着变化。通常观察到松果菊苷（1.35-387.50mg / g）是最丰富的组分，而阿魏酸（lt;0.0043mg / g）总是表现出痕量分布。最重要的是，集成设备设置可以作为CT的深入质量评估的适用工具，更重要的是，用于全面了解植物的代谢组。

  1. 介绍

给定的植物总是表现出极其复杂的化学池，由许多初级和次级组成。代谢产物[1–3]. 代谢组不仅能够反映生理模式，还能反映药理学价值;因此，代谢组分析符合植物生理学家和药理学家的要求[4–7]. 然而，实现全面可靠的信号采集的技术障碍在于为亲水性和疏水性物质提供令人满意的色谱性能，以及为丰富的物质提供令人满意的光谱性能。

使用高效液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）测定痕量组分[8].

虽然已经开发了各种创新技术用于改善复杂基质的色谱结果，如核壳型和亚微米级颗粒，整体柱，亲水相互作用色谱柱等，但普遍保留仍然是一项具有挑战性的任务。然后使用单个列分离这些不同的组件[9,10]. 多柱色谱结合了至少两种正交色谱机制，如二维液相色谱，柱切换液相色谱和串联双柱液相色谱，已被认为是显着延长代谢物覆盖率的可行工具。毫无疑问，二维LC或列切换LC能够显着扩展峰容量[11]; 然而，这两种设备方案都依赖于阀门，从而导致复杂的仪器，耗时的测量，以及那些连接管和调节器中的显着残留物，以及与引入一系列不确定性相关的不可重复的定量[8]. 尽管在峰容量方面有所妥协，但串联偶联反相 - 亲水相互作用色谱（RPLC-HILIC）仍然具有吸引力，无论极性如何都能实现多种化合物的全面保留，这归功于仪器设置简便以及管和调节剂中无残留物在从亲水到疏水的宽极性覆盖的前提下[12–17]. 此外，多重反应监测（MRM）模式对三重四极杆（QqQ）质谱仪的特异性可以作为另一个分离维度，以抵消RPLC-HILIC的分离潜力，因为每个分析物具有独特的离子跃迁。因此，RPLC-HILIC-MRM有望成为整合这三个项目固有优势的可行方法。

给定工厂中的组件通常具有较宽的内容范围。与那些主要成分相比，人们越来越关注开发更灵敏的方法来完成痕量甚至超痕量化合物的检测。通常建议使用MRM模式，因为它具有出色的灵敏性和良好的线性动态范围[18]. 然而，在可靠地监测这些痕量组分的前提下，定量上限（ULOQ）不能完全覆盖某些主要化合物的含量并不令人惊讶。基于MRM的定量的概念是对定义的产物离子进行计数，并且由于QqQ质谱仪的Q3室末端的电子倍增器的饱和，线性范围通常变窄。因此，有意义的是，可以根据故意抑制产物离子的产生来扩大ULOQ。使用劣质化合物相关参数，例如离子跃迁，去聚电位（DP）和碰撞能量（CE），可以降低碎片离子密度[19,20] 并因此扩展ULOQ。

与其他一些Orobanchaceae植物无处不在的分布不同，Cistanche tubu-losa（CT）通常与沙漠中的宿主（主要是T柳属植物）共存是非常有趣的。此外，干燥多汁的CT茎是着名的滋补药物Cistanches Herba（中文名：Roucongrong）的来源，被誉为“沙漠人参”，广泛用于治疗腰部和膝盖疼痛，女性不育和传统中医的便秘[21,22]. 因此，植物生理学家和药理学家都对其代谢组谱感兴趣，包括亲水性和疏水性化合物，以了解抗旱性，独特寄生性和治疗益处的潜在机制。除了提到Cistanches Herba时苯乙醇苷总是占据热点，其他一些药理学贡献亲水性成分如甘露醇也已得到公认[23–25]. 此外，在我们的常规定量分析中，这些主要成分（例如，松果菊苷，阿维甙和甘露醇）的反应有时太高而不能超过紫外检测器和/或蒸发光散射检测器（ELSD）的测量极限，这是非常烦人的。 CT。因此，从整体质量评价的观点出发，开发一种能够同时监测那些也包含很大含量范围的亲水和疏水成分的实用方法是非常重要的。

因此，本研究的目的包括开发适用于复杂基质的稳健方法，以及澄清CT中生理网络的那些重要终点的定量性质。为了响应极性方面的大跨度，配置了RPLC-HILIC，并且在MS / MS域上进行了智能修改以与显着的内容范围很好地匹配。共有23种丰富的和次要的分析物覆盖CT中的大多数化学簇，用于验证RPLC-HILIC-MS / MS用于大规模定量分析的能力。该综合方案有望为更有效的CT质量控制提供可行的工具，并有利于实现广泛靶向的植物代谢组学。

实验

2.1化学品和材料

根据我们之前的研究，选择了23种化合物，这些化合物涵盖了CT中的大多数化学类型并且具有宽极性范围，被选为靶标。其中，烟酸（cLogP，0.799）和琥珀酸（cLogP， 0.526）获自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA）。四种核苷，即尿苷（cLogP，2.219），腺苷（cLogP，2.158），肌苷（cLogP，3.106）和鸟苷（cLogP，3.326），由新京科生物技术公司（中国北京）提供。红景天甙（cLogP，0.296），6-deoxycatalpol（cLogP，3.071），苯丙氨酸（cLogP， 1.556）8-ε-链烷酸（CLogp）， 2.366），甘露醇（cLogP，2.046），蔗糖（cLogP，3.087），gluroside（cLogP，1.757），alaschanioside A（cLogP，0.971），echinacoside（cLogP，1.811），阿魏酸（cLogP，1.421），acteoside（cLogP） ， 0.890），异麦芽糖苷（cLogP，0.057）和松脂醇-d-吡喃葡萄糖苷（cLogP，0.384）从北京大学天然药物和仿生药物国家重点实验室（北京，中国）的化学库中获得。Cistanoside F（cLogP，2.211）购自Mansite Bio-Technology Co.，Ltd。（中国成都）。Cistanoside A（cLogP，1.365）和21-acetylacteoside（cLogP，0.040），以及作为内标（IS）的liquiritin apioside（cLogP，0.267）由Standard Biotech Co.，Ltd。提供。 （上海，中国）。Tubuloside A（cLogP，0.287）购自Weikeqi Bio-Technology Co.，Ltd。（中国成都）。通过HPLC-DAD-IT-TOF-MS（Shimadzu，Tokyo，Japan）测定每种参考化合物的纯度大于98％。所有感兴趣的化合物以及IS的结构如图所示图。1。使用ChemBioDraw Ultra 14. 0软件计算所有cLogP值ware（CambridgeSoft，Cambridge，MA，USA）。

从中国新疆自治区和甘肃省收集20批CT（CT1-CT20）（表S1，补充资料A）。所有的植物来源都被鉴定为C. tubulosa（Schenk）的干燥多汁茎。

R. Wight由作者之一（P.-F. Tu教授）撰写。所有凭证标本均存放于北京中医药大学现代中药研究中心（中国北京）的植物标本室。

HPLC级甲酸和甲醇以及乙腈（ACN）购自Thermo-Fisher（Pittsburgh，PA，USA）。使用Milli-Q系统（Millipore，Bedford，MA，USA）在内部制备去离子水。其他化学品为分析试剂级，购自北京化工有限公司（北京，中国）。

2.2样品制备

将所有可靠的化合物溶解在甲醇或水中以制备储备溶液。将5mu;L等份的每种储备溶液用50％甲醇水溶液稀释至适当浓度（50-100ng / mL）。获得的解决方案用于质谱参数优化后推荐的协议[10] 并且还用于在提取物的色谱图中分配信号。通过混合适当体积的所有储备溶液并用50％甲醇水溶液稀释来提供完全混合的标准溶液，得到连续工作标准样品。然后，用含有IS的15％ACN水溶液（终浓度，138ng / mL）将每种工作标准溶液进一步稀释200倍，得到一系列校准样品。使用具有强制对流的通风烘箱（FD115，Tuttlingen，Germany）在40℃ ◦下干燥所有原料（CT1-CT20）5天。将干燥的样品用研磨机（型号YF102，瑞安永利制药机械公司，浙江，中国）粉碎，然后通过50目（0.25mm，内径）扒炉筛分。将1.0g等份的每种CT样品悬浮在烧瓶中的50mL 50％甲醇水溶液中，并用超声波发生器（230V，Branson model 5510，Dan-burry）在水浴（20 ◦C）中萃取30分钟。 ，CT，USA）。在超声波辅助提取后，加入50％甲醇水溶液以补偿提取过程中的重量损失。然后，将每种提取物以10000g离心10分钟，并将上清液通过0.22mu;m膜过滤。与校准样品平行，每个滤液用IS进一步稀释200倍（最终浓度，在测量之前，将25％ACN水溶液加入到138 ng / mL中。

2.3 RPLC-HILIC-MS / MS测量

关于LC领域，Shimadzu模块化LC系统（日本京都）由四个LC-20ADxr 泵（泵A-D），SIL-20ACXR自动进样器，CTO-20AC柱温箱，DGU-20A组成3r 使用脱气装置，HP混合器和CBM-20A控制器。另一方面，安装有电喷雾电离（ESI）源的SCIEX 5500 Qtrap质谱仪（Foster City，CA，USA）负责MS / MS检测。通过遵循文献中的描述来设定负极性的离子源参数（也称为与化合物无关的参数）[26]. 所有感兴趣组分的前体 - 产物离子跃迁以及使用推荐方案手动优化的IS，DP和CE值[10] 总结于表格1。此外，采用预定的MRM（sMRM）算法监测其预期保留时间窗口内的所有离子跃迁，以保证所开发方法的可重复性。[26]. 对于每个离子跃迁，检测窗口设置为90s，并且目标扫描时间保持在1.0s。Analyst Software软件包（版本1.6.2，SCIEX）用于同步整个系统，以及数据采集和处理。

通过使用泵C和D联合递送稀释溶剂，RPLC在线与HILIC联用。RP分离在Waters Acquity UPLC HSS T3柱（2.1 100 mm，1.8mu;m，Milford，MA，USA）上进行，作为前分离模式，泵A和B负责提供0.1％（v / v）含水甲酸酸（A）和ACN（B）分别进入T3塔。梯度洗脱程序如下：0-4分钟，10％B;4-8分钟，10％-20％B;8-22分钟，20％-55％B;22.1-30分钟，10% B;和流速，0.15 mL / min。第一个柱后的HILIC分离在Waters Xbridge Amide柱（4.6 150 mm，3.5mu;m）上进行，泵C和D负责输送含有0.1％甲酸（C）和ACN（D）的水，按照以下梯度程序，以1.0mL / min的总流速分别进入HP混合器：0-4分钟，100％D;4-8分钟，100％-84％D;8-22分钟，84％-61％D;22.1-30分钟，10％D。两者将柱恒温至40 ◦C。注射量

自动进样器设置为2mu;L，直接传输到T3色谱柱。仪器的简要方案如下所示图2。

此外，还进行单柱LC以评估RPLC-HILIC的优点。为了确保平行测量，RPLC-HILIC和单列RPLC或HILIC之间的差异仅使用长度相当的PEEK管（0.13 mm，内径）替换T3色谱柱（单柱RPLC）或Amide色谱柱（单色柱HILIC）。

2.4 方法验证

随着该方法的发展，使用包含所有23种分析物的全混合标准溶液测定关于线性，检测限（LOD），定量下限（LLOQ），精确度，重复性，稳定性和回收率的定量术语。使用相对标准偏差（RSD％）确定所有变化。

2.4.1 线性及灵敏度

上面制

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