羟基红花黄色黄 A 对骨髓骨髓间充质干细胞神经分化过程中β-巯基乙醇氧化损伤的保护作用外文翻译资料

 2022-05-04 20:53:25

羟基红花黄色黄 A 对骨髓骨髓间充质干细胞神经分化过程中beta;-巯基乙醇氧化损伤的保护作用

摘要

为了研究羟基红花黄色黄 A (HSYA) 对体外诱导骨髓骨髓间充质干细胞 (MSCs) 神经分化过程中beta;-巯基乙醇 (BME) 氧化损伤的保护作用。当融合达到50%-60%, 第四通道 MSCs 分为三组进行培养。G1: 用基本培养基培养的正常组 (DMEM含10% 血清);G2: 不受保护的组, 连续培养使用基本培养基24小时, 然后用预诱导培养基 (DMEM 含10% 血清和1毫摩尔/升 BME) 进行培养;G3: 采用保护性培养基 (DMEM 含10% 血清和160毫克/升 HSYA ) 的保护组, 培养24 小时, 再用预诱导培养基进行24小时培养。在上述治疗后, 分别检测细胞活力、SOD/GSH 的相对水平和凋亡率。用免疫印迹法考察了Bcl和Bax 的表达。经过 HSYA保护和 BME 预诱导, 进行了神经诱导。分别分析了 NSE 和 MAP-2 在细胞和分子水平上的表达。结果与无保护组相比, 160 毫克/升 HSYA能明显改善细胞活力, 维持高的 SOD 和谷胱甘肽, 降低细胞凋亡率, 提高Bcl与Bax 的比值。160毫克/升 HSYA保护后, 神经元样细胞的存活时间可以延长。免疫细胞化学染色表明, 10 小时的神经诱导后, 受保护组的分化神经元样细胞仍处于良好状态, 在检查诱导过程中, NSE 和 MAP-2 的 mRNA 水平增加。结论 HSYA能提高细胞对 BME 致氧化损伤的抵抗力。

关键词

羟基红花黄 A;beta;-巯基乙醇; 骨髓骨髓间充质干细胞;神经分化;防护效果

1. 引言

帕金森病 (PD) 是一种神经退行性疾病, 其特点是黑质多巴胺能神经元丢失, 导致慢性运动障碍, 严重影响患者及其家庭的生活质量。在良好状态下, 用分化神经元替换丢失的细胞是修复受损脑神经元的一种越来越有前途的方法。目前, 许多类细胞, 如胚胎干细胞 (Montzka et al, 2009) 和神经干细胞 (Lee et al, 2014) 都可以诱导成神经元。然而, 组织资源限制和社会伦理问题限制了它们的临床应用。骨髓间充质干细胞 (MSCs) 是一种以自复制和多向分化为特征的成体干细胞类型。因为他们很容易获得 (Kim et al,2014;Jin al, 2015;Han et, 2015) 并没有显著的免疫原性 (Shi et, 2012), MSCs 被认为是有吸引力的候选者在临床应用修复或再生损伤组织。

目前, 骨髓间充质干细胞已应用于不同药物的神经分化, 如骨形态发生蛋白 (BMPs) (Tio et al, 2010; Woodbury et al, 2000), 全反式维甲酸 (RA) (Jin et al, 2015), 脑源性神经营养因子 (BDNF) (Shi et al, 2012), 中药 (Huang et al, 2013;Ruan等 al,2015;Fu等, 2014) 等。与其他方法相比, 采用 BME 结合生长因子 (如 bFGF 或 EGF) 的神经诱导法几乎是典型的。高分化率是其优势, 但与之相区别的神经元样细胞的生存时间较其他的短。因此, 迫切需要一种新的方法, 可以快速地将 MSCs 转化为期望的神经元, 具有长期生存率。为了改善细胞活性, 中国学者许 (Xu et al, 2010) 用葡萄籽原花青素在 BME 诱导治疗前保护 MSCs, 结果表明, 保护效果非常显著。鉴于羟基红花黄色黄 A (HSYA) 对神经损伤的保护作用 (Lu et al, 2008; Zhu et al, 2005;Yang et al, 2010), 我们使用含有160毫克/升 HSYA(Lu et al, 2008) 在 BME 治疗前培养 MSCs, 以探讨 HSYA对 BME 引起的氧化损伤的保护作用, 并获得高度分化的神经元样细胞。

2. 实验材料与方法

2.1 MSCs的分离与培养

在我们的实验中, 4 周大的雄性 SD 大鼠 (从河北北部大学动物中心购买, 并在国家卫生研究院的实验室动物护理和使用指南下进行的实验性治疗) 用 ip注射0.5 克/千克水合氯醛来进行麻醉。用5毫升一次性注射器将股骨 (GIBCO) 含10% 血清 (GIBCO) 的碱性中 L-DMEM (i.) 进行冲洗, 以收获 MSCs。在反复搅拌后, 分离细胞在 25 cm2 培养瓶中培养。在湿润条件下，加上5％CO2，细胞孵化器的培养条件保持在37度。经过48小时的培养，随后每72小时更换培养基。当细胞融合达到80％-90％，用0.05％（w/v）EDTA来提取胰蛋白酶细胞。细胞悬液分成两个培养瓶，直至传代第四次。

2.2用流式细胞仪测定细胞表面抗原

用流式细胞仪 (FCM) 对 MSCs 的表面标记进行了分析。第四通道MSCs的密度约为106／ml；10个大鼠特异性抗体: CD29、CD34、CD45 和 CD90 (BD Pharmingen) 分别添加到含有 MSCs 的管底。该混合物在室温下保持在30分钟, 在黑暗中, 阳性细胞被发现。鼠 IgG1 (BD Pharmingen) 作为同型对照。

2.3 细胞活力和凋亡的检测

将105细胞/mL 密度的 MSCs 植入96孔板中, 用含 5% CO2碱性培养基在 37度中培养。当细胞融合达到50%minus;60% 时, 所有含 MSCs 的孔板被分为三组, G1: 正常组在基本培养基中培养;G2: 不受保护的组在碱性培养基中连续培养24小时, 然后在预诱导培养基 (l-DMEM, 含10% 血清和1毫摩尔/L BME) 中培养 24 h;G3: 保护组首先培养的保护培养基 (l-DMEM 含10% 血清和160毫克/升 HSYA) 24 小时, 然后在预诱导培养基中培养为 24 h. 在上述治疗后, 用 MTT 法测定各组细胞的生存能力(Wang et al,2001)。简而言之, 培养基被5毫克/毫升 MTT 取代。在细胞孵化器 37度孵化4小时后, MTT 培养基被去除, 细胞用 PBS 清洗三次, 随后将 150 ul 亚砜添加到每个含细胞溶解。每一个井的吸光度由 ELISA 读取器测量 570 nm。此外, 为了进一步检查 HSYA是否能降低细胞凋亡率, 进行了双荧光染色。这三组细胞分别与赫斯特33258和碘碘化物 (PI) 染色, 以计数细胞凋亡率。

2.4超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的测定

为了评价 MSCs 的抗氧化能力, 测定了两种主要晶状体 SOD 和 GSH 的相对水平。培养的骨髓间充质干细胞首次种植成6个板块, 直至50%minus;60% 融合。然后, 对 '2.3' 中提到的方法进行了处理, 并分别采集了细胞。蛋白质浓度的测定 (BestBio, Shanghai, China) 后, 总蛋白提取。根据制造商的指示, 用工具箱测量 SOD 和 GSH 的含量。

2.5 bcl和Bax的表达分析

收集三组骨髓基质干细胞, 在冷冻条件下进行蛋白质提取。在测定蛋白质浓度的条件下, 用15微克蛋白混合到每个样本中并用11% SDS缓冲分离使用。蛋白质电泳后, 蛋白质通过电转移到 PVDF 膜上。在室温下, 用10% 非脂牛奶阻断了该印迹, 防止非特异性蛋白的结合;然后分别用兔抗大鼠Bcl和 Bax (1:1000) 抗体在 37度上孵化2小时。用TBS-T缓冲液冲洗后, 用山羊抗兔二级抗体 (1:1000,Boaosen, Beijing, China) 。最后，使用DAB做色剂对目标频带进行着色。蛋白带由 ECL (美国密理博公司) 可视化。利用三到五独立印迹的平均面积和波段强度对各数据点进行分析。所有实验组均采用抗beta;肌动蛋白抗体 (1:2000) 作为负荷控制。

2.6 神经分化和免疫细胞化学分析

106细胞/毫升密度的 MSCs 在6板上的幻灯片上培养。当融合到达50%minus;60% 时, 通过无保护和保护组的方法治疗 MSCs。在 HSYA和 BME 的培养后, 增加了神经诱导培养基 (DMEM/F12, 含10的碱性 bFGF 10 ng/升 EGF) 诱导神经分化。在分化过程中, 细胞被密切观察。为了检测骨髓骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的成熟度, 采用免疫细胞化学方法对10小时神经诱导后的 MAP-2 进行了两种神经元标记。用冷 PBS 冲洗三次, 有分化细胞的幻灯片;在室温下分别进行了4% 多聚甲醛、0.3% Triton-X100 和 2% BSA 通透的固定。随后, 增加了主要抗体 (PBS, Abcam 1:300 稀释), 并将孵化保持在 37度2 小时。用 pbs 缓冲剂洗涤后, 对山羊抗兔次生抗体-PE/FITC (pbs、Abcam 1:200 稀释) 进行孵化, 制备30分钟。最后, 赫斯特33258被用来染色细胞核。利用电子和计算机模块 (实时控制系统) 对这两种神经元蛋白标记的表达进行了分析。十个领域的观点从三个独立的实验被用来测量 NSE 和 MAP-2-positive 细胞的速率。

2.7 实时pcr分析

为了进一步分析 NSE 和 MAP-2 基因的表达模式, 进行了实时 PCR 扩增。在3、6和 10 h 中加入诱导培养基后, 分别收集了无保护和保护组的分化神经元样细胞, 采用 RNA 提取试剂盒 (Invitrogen) 提取所有 RNA。cDNA 合成试剂盒 (美国 Invitrogen) 根据试剂盒的指示生成。反向转录反应系统包含12.5 毫升功率 SYBR 绿色 PCR 主混合, 500 ng cDNA, 25 毫摩尔/升每一个底漆 (表 1), ddH2O 补充到25毫升。PCR 参数如下:94度预变性5分钟;35个周期94ordm;C 退化40秒, 53minus;55 度退火30秒和72ordm;C 扩展2分钟;最后72ordm;C扩展10分钟。

2.8 统计分析

用 SPSS 17.0 软件对数据进行了分析, 并以 xplusmn;s表示。通过方差分析和 Plt; 0.05 对组间数据进行分析, 具有统计学意义。

3. 结果

3.1 骨髓间充质干细胞形态学及表面抗原谱检测

2天的初级培养后, 细胞附着在塑料烧瓶的表面, 甚至开始拉长 (图 1A)。7minus;8天培养后, 黏附细胞80%minus;90% 融合, 培养细胞逐渐表现为纺锤形形态 (图 1B), 而非黏附细胞通过改变培养基逐渐移除。现在细胞用胰蛋白酶提取, 进行第一次培养。培养和传代交替进行, 直到细胞超过第四代, 与成纤维状的第四 MSCs 可以看到的差异快速染色 (图 1C)。FCM 结果表明, 骨髓骨髓间充质干细胞具有 CD29 (99.7%) 和 CD90 (86.3%) 的高表达, CD34 和 CD45 在 MSCs 中的表达几乎没有, 分别为1.3% 和 12.1% (图 2), 因此, 我们的研究中培养的细胞能够满足 MSCs 的特性。

表1实时 PCR 的引物序列

图 1 MSCs 的形态学外观

A: 在 2 d 的原代培养后, 附上细胞环顾四周或拉长;在培养7minus;8后, 黏附细胞变得汇合;C: 第四代 MSCs 染色的差异-快速

图2经流式细胞仪检测的第四阶段

MSCs 的免疫分型结果对 CD90 和 CD29 有强烈的阳性反应, 而阴性 CD34 和 CD45）

3.2 细胞生存能力与细胞凋亡的检测

为了检验细胞的生存能力, 进行了MTT试验。MTT法测定的 OD 值间接反映了琥珀酸 脱氢酶细胞活力的活性。正常组的细胞活力被认为是 100% (表 2)。结果表明, 无保护组的 OD 值明显低于正常和受保护组 (p 0.01, p 0.05), 正常和受保护组的值无显著性差异。赫斯特33258和 PI 检测细胞凋亡率 (图 3), 染色结果表明, 正常和受保护组的活细胞比例无显著性差异。然而, 无保护组的凋亡率明显高于其他组。因此, BME 治疗前的 HSYA保护能改善细胞活力, 降低骨髓骨髓间充质干细胞的凋亡率。

表2细胞活力的检测( x plusmn; s , n = 5 )

图 3 三组双荧光染色

分别用蓝色和红的染料显示存活和死细胞

3.3 Measure of SOD and GSH

在我们的研究中, 这些试剂盒用于测量 SOD 和 GSH 的含量。正常组 SOD 和 GSH 的相对含量分别为100%。受保护组 SOD 相对活性占正常组的70% 以上, 且受保护组的 GSH 相对含量超过 80%, 明显高于无保护组 (P 0.01) (图 4)。因此 HSYA保护有利于细胞抵抗 BME 引起的氧化损伤。

图 4 SOD 和 GSH对正常组的相对水平正常组

SOD和 GSD的相对含量分别被视为100%

3.4免疫印迹分析

为了进一步分析 HSYA能否有效抑制细胞凋亡, 对 Bcl和 Bax 进行了印迹分析。染色试验结果表明, 正常组 Bcl表达率最高, 无保护组最低。Bax 表达在正常组中最低。与无保护组相比, 160 毫克/升 HSYA治疗可降低 Bax 的表达。即, 与未受保护的组相比, HSYA可以显著增加 (图 5) 的值。

图5免疫印迹分析Bcl和 Bax 表达方法

无保护组的 Bcl/Bax 率明显低于其他人 (P lt; 0.05)

3.5 神经分化与免疫细胞化学

在诱导介质的最终神经诱导过程中, MS

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