草药鉴定的复兴:从形态学到DNA外文翻译资料

 2022-05-12 21:01:30

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草药鉴定的复兴:从形态学到DNA

摘要

由于使用了不准确的药用植物成分，引起了许多不良反应，导致了马兜铃酸肾病和乙型肝炎的中毒。这个问题已经引起了全球对草药安全性的担忧。DNA条码技术是一种旨在检测DNA短区域内物种特异性差异的技术，为解决这一问题提供了一个强有力的新工具。基于两位点组合的ITS2 psbA-trnH条码，建立了DNA条形码的初步系统。在该系统中，有78,847个序列属于23,262个物种，其中包括中国、日本、韩国、印度、美国和欧洲等国家的95%以上的天然草药。该系统已广泛应用于传统中药材企业。本文综述了近年来药用植物（中草药）的DNA条形码技术的研究进展，以此作为对安全有效的草药的贡献。

关键词

DNA条形码；植物鉴定；不良反应；安全性；ITS2；psbA-trnH

介绍

中草药在预防和治疗各种疾病方面有着悠久且确切的历史，在现代医疗和卫生服务中持续获得全球影响力。然而，鉴于药用植物的数量和种类繁多(估计有超过7万种不同的品种)，能够可靠地将它们区别于近亲、劣质的替代品、掺杂物和假药，这威胁到了病人安全和人们对草药功效的信任。由于对草药材料鉴定的不准确，全球出现了许多与安全有关的问题。例如,来自粉防己用于制作减肥药的草药成分防己根,无意中被广防己根所替代,导致女性在服用这些药物后出现进行性肾功能衰竭。马兜铃草中含有马兜铃酸、马兜铃属的天然化合物，可引起上尿路的肾毒性和尿路上皮癌。2000年，美国食品和药物管理局提醒消费者不要使用含有马兜铃酸的草药。尽管有这样的警告，这种草药的销售仍在继续。2004年，据报道有三名患者被证实患有马兜铃酸肾病相当长时期，这些患者摄入了无害的抗肿瘤药白英；进一步的研究表明，这种物质是寻骨风中含有的马兜铃酸。关于来源于杠柳的香加皮的使用安全问题也有报道。大多数的香加皮中毒事件都是由于用来源于细柱五加的五加皮来取代了香加皮。在所有这些例子中，造成问题的原因是对植物成分的鉴定不准确。因此，对药用植物成分的正确鉴定对它们的安全使用至关重要。

传统的药材鉴定方法主要包括形态学、显微鉴定和化学鉴定。自1811年由奥地利医师施密特定义的生药学诞生以来，这些技术在草药鉴定和质量控制方面发挥了关键作用(无论是在自身还是在组合中)，并继续为全球药典使用的提供主要方法；然而，像所有的技术一样，它们也有局限性。不仅其结果的准确性依赖于训练有素的专家的操作，而且他们的稳定性也反映了鉴定性状的存在和知识使一种植物成分与另一种植物成分得以区分；这对于有着相似形态或化学结构的相近物种和植物部分尤其重要。由于这些特征和我们对它们的认识在不同物种之间有很大差异，降低了结果的可靠性，因此需要其他的方法。DNA“条形码”的概念提供了一种实用的解决方案，既可以作为独立的身份验证方法，也可以用来强化这些传统的方法。

DNA条形码是一种用于根据其DNA短区域内物种特异性差异鉴定物种的技术。该方法自2003年问世以来，已引起了广泛的研究兴趣。DNA条码不受形态学特征和生理条件的限制，不需要专业分类学知识即可进行物种鉴定。该方法也针对特定的DNA条形码和通用引物进行了标准化，这有利于建立数据库和建立一个通用的鉴定标准。DNA条形码可以实现对来自不同范围和原材料质量的物种进行快速，准确和自动识别。这解决了对草药材料分类所面临的难题，并促进了草药识别的分类复兴。本文总结了草药材料DNA条码研究的重要进展，重点在三个方面：建立草药材料的DNA条码系统，DNA条码系统的关键技术以及未来DNA条码编码的研究方向草药材料。

建立基于ITS2和psbA-trnH条码的药材DNA条码系统

为了使DNA条码信息具有普遍性和公众可获取性，在线数据库需要进行编辑并在线提供。加拿大DNA条码中心建立了首个在线DNA条码数据库，即生命数据系统条码。该数据库目前记录了植物使用matK和rbcL的条形码结果，真菌的ITS和动物的COI。我们也可以在生活数据系统的条码中创建项目，这些项目是公开可用的。另外两个数据库，植物和动物的IdIt-ITS2和PTIGS-IdIt，已被开发以促进ITS2和psbA-trnH条形码的应用。生物体专用数据库也可用，包括鳞翅类的生命条码和鱼的生命条形码。2010年，楼等人为药物材料开发了一个DNA条码数据库，该药物DNA条码数据库接受药用植物材料的所有质体DNA区域和细胞核的ITS检测结果。

最近，一个基于ITS2和psbA-trnH条形码的通用的、公开可用的DNA条形码识别系统被建立起来了(图1)。该系统已被用于鉴定草药材料，并且方法已被批准纳入中国药典（2010年版）第3版。在DNA条码系统开发过程中，如图1所示，根据各物种的表型对其标本进行了验证。此外，可以使用该系统对其DNA条码的药草表型进行检查。此外，还建立了一个草药材料的在线DNA条码数据库，该数据库为草药材料提供了物种识别模块。在这个数据库中，ITS2和psbA-trnH被选作草药材料的核心和补充DNA条形码。为了正确区分药用物种，该数据库还包含其伪品，替代品和密切相关物种的条形码数据。目前，该数据库中有来自23,262种的78,847种条形码序列用于鉴定草药材料（表1）。其中，根据我国自己的和其他在中国的草药研究（表1），生成了6,815种的30,886个序列。该数据库包括中国药典，日本药典，韩国药典，印度药典，美国药典和欧洲药典中列出的几乎所有草药（表2）。这个数据库中的数据将每六个月更新一次。该数据库还包含草药材料DNA条形码的方法，该方法为初学者提供了一个标准工作流程和分步指南，介绍如何使用DNA条形码进行物种鉴定。任何对草药材料的DNA条码感兴趣的用户都可以自由访问数据库。用户可以使用识别模块将其序列粘贴到输入框中以执行识别功能。这些查询序列应该长于150bp，可以是带有“gt;”标识符的FASTA格式，也可以是核苷酸 没有“gt;”标识符。点击提交按钮后，BLASTN算法被激活，并且所有参考序列中最近的邻居都可用。对于包含在数据库中的物种，当发现与参考序列紧密匹配时，识别模块可以给出物种水平识别。当发现物种水平匹配时，将给出最匹配物种的拉丁学名，并且还可以连接数据库中可用的其他相关数据。

草药材料DNA条码系统的关键技术

选择ITS2和psbA-trnH区域作为药材的条码

DNA条形码研究主要旨在开发通用DNA条形码或标记。在植物中，DNA条码主要来自于质体和核基因组，并且已经推荐了这些基因组中的各种通用DNA区域。2009年，生命条码联盟植物工作组（CBOL）将7种候选标记（rbcL，matK，rpoC1，ropB，psbA-trnH，psbK-psbI和atpF-atpH）在代表550个物种的907个样品中，并建议联合使用matK和rbcL作为条形码开发的标准植物标记。核内核糖体DNA（nr ITS / ITS2）和 psbA-trnH 的内部转录间隔区被认为是重要的潜在条形码，需要进一步检查。扩增的困难限制了它成为草药的核心条形码。扩增困难的主要原因是许多草药中高度降解的DNA。克服这个困难涉及到了整个ITS。ITS2由于其序列保守且短得多，是不错的选择，这降低了扩增的难度。Chen的团队以这个独创性的创新为DNA条码数据库做出了贡献，下文将进一步讨论。2010年，使用各种药用植物及其近缘种评估了7个DNA区域（psbA-trnH，matK，rbcL，rpoC1，ycf5，ITS2和ITS）（Chen等，2010）。使用ITS2记录了高度的变异性和物种鉴别，ITS2正确地鉴定了来自753个属的4800个物种的6600多个样品中92.7％的物种。因此，ITS2被提出为药用植物的核心DNA条形码。另外，psbA-trnH区域被建议作为补充条形码。姚等人和中国植物保护组织（BOL Group）随后验证了ITS2作为植物DNA条形码在大样本中的有效性，并申请了更广泛的植物分类群。ITS2在物种鉴定方面的能力已在许多其他案例研究中进行了测试。例如，在蔷薇科物种中，ITS2正确鉴定了96个属中893个物种的1410个样品中的78％。在特定的药用植物研究中，豆科植物家族中有24种（包括它们的混合物）被准确区分，而来自卷柏科34种物种的103个样本被正确地鉴定出来。罗等人发现ITS2是对芸香科中72个属的192个物种的300个样品进行条形码鉴别最有效的区域。此外，庞等人成功地使用ITS2条形码来区分草药材料，而孙和陈实验表明ITS2条形码可以很好地区分中国药典中列出的皮质草药。ITS2条形码在鉴别紫菀科、大戟科、 唇形科和姜科等方面也表现良好。此外，来自同一物种的不同个体可能含有不同的成分，因为这些物种通常分布在广泛的地理区域并且包括不同的基因型。利用ITS2反映种内遗传变异也已被成功证明。侯、宋、辛等人的结果表明，ITS2条码具有小的种内和种内变异，但种间变异较大。

尽管使用ITS2条码取得了成功，但它在植物中的普遍适用性仍然受到了质疑，因为在单个个体中存在多个ITS2拷贝，而它们并不总是通过一致的进化过程同质化。此外，当不同质化时，来自给定个体或物种的一些拷贝可能与近亲属物种的拷贝更相近，这可能导致识别错误。同样，杂交由于ITS2遗传的双亲性质，也会导致类似的问题。然而，中国植物保护组织进行的研究表明，由于行为学的原因，只有7.4％的序列是不可读的。宋等人进行了焦磷酸测序以测试ITS2区域内的基因组内变异以便直接评估旁系同源序列拷贝的影响。获得来自178种植物物种的ITS2区域的5000个以上的基因组内变异，每种物种的平均35个主要和次要变体。在大多数情况下，只能使用主要变种充分鉴定物种，而次要变种能够加强ITS2的物种鉴定能力。沃尔夫等人采用了宋的454焦测序数据，并考虑到基因组内变异性，重新考虑了与补偿性基础变化（CBC）有关的标准。这项研究发现，ITS2拷贝中不存在基因组内CBCs的概率是〜 0.99（99.99％），与CBC物种概念一致，并进一步得出结论，应该将ITS2用作标准植物条形码。psbA-trnH区域作为ITS2的补充条形码对药用植物的有用性也在许多研究中得到证实。图2总结了用于识别草药材料的标准条形码的选择和应用的研究。

建立草本材料DNA条码数据库的开发步骤

建立草药材料DNA条形码数据库包括样本收集，证件标本验证，DNA提取，PCR扩增，测序，序列组装，最后是物种鉴定。

样品收集和形态学验证

为了开发可靠的条形码数据库，确保源植物的身份至关重要。每个物种至少需要三个重复收集; 每个集合（唯一编号）需要包括一个用于DNA提取的小型植物样本，以及整个植物（理想的开花或结果）的证书标本标本样本，并且来源于同一植物或植物种群。这些收藏品应附有照片和详细的现场笔记，描述标本标本中不明显的任何标识字符（例如收集者姓名和联系信息，GPS位置，栖息地，植物高度，花色）。样品必须处于良好状态（例如，没有真菌，昆虫或其他侵害）。有关制作植物标本标本的详细指南可以在《植物标本手册》中找到。

DNA提取

高质量的基因组DNA是使用DNA条形码进行准确鉴定的重要先决条件。因此，草药材料的DNA提取必须小心，快速并使用良好的无菌技术进行，以避免DNA降解和样品之间的污染。草药材料通常在使用前很久才收获。结合最近的参考文献和我们的研究，可以使用不同的草药材料（包括根，果实，茎，叶和花）成功进行可靠的条形码识别草药鉴定。今后，系统地研究储存时间，储存条件和加工方法对草药DNA条形码的影响。在这里，我们总结了DNA提取不同草药材料时要考虑的关键点。

根，根茎，茎，和皮层材料

通常，草药材料的表面在用液氮中的细粉末研磨之前用75％酒精清洗以用于DNA提取。在大多数情况下，以根茎和根茎为主的草药具有高水平的多糖和多酚。在DNA提取的早期阶段，必须使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和beta;-巯基乙醇将其去除。根茎和根茎为基础的草药含有丰富的纤维和植物能量储备，包括淀粉，并且通常必须增加材料和相应提取化学品的量。皮质草药含有丰富的薄壁组织和纤维; 因此，对于DNA提取，必须相应增加植物原料PVP和beta;-巯基乙醇的剂量。

叶子和花材料

叶和花中纤维和干扰次生代谢物含量通常很低，因此，往往是最容易提取高质量DNA的组织。对于更新鲜、健康的叶片，直接PCR方法足以获得目标DNA条码。然而，对于许多其他材料，如干根、茎和果实，这种方法是无效的，因为这些材料含有许多次生代谢产物，破坏了PCR扩增。在我们看来，就直接PCR方法而言，通过使用适当的植物组织进行DNA提取可以节省时间。

水果和种子材料

水果和种子为基础的草药通常具有高含油量，这可以妨碍研磨并导致低DNA产量。因此，起始材料的量必须增加。丙酮可用于提取碾磨材料以除去脂溶性酚类化合物。

PCR扩增和测序

ITS2和psbA-trnH 分别用作标识草药材料的标准和补充DNA条形码。ITS2条形码的通用引物是S2F（5#39;-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3#39;）和S3R（5#39;-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3#39;）。psbA-trnH条码的通用引物是FWD PA（5#39;-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3#39;）和修订版TH（5#39;-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3#39;）。用于PCR扩增的反应条件和组分可以在之前的研究中找到。纯化的PCR产品需要在两个方向上进行测序。

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