药用植物的DNA条码 用于鉴定来自中国的钩藤属物种外文翻译资料

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药用植物的DNA条码

用于鉴定来自中国的钩藤属物种

作者：Zhong-Lian Zhang , Mei-Fang Song, Yan-Hong Guan, Hai-Tao Li , Ying-Feng Niu , Li-Xia Zhang , Xiao-Jun Ma

要点：

bull;筛选适用于钩藤属植物的DNA条码。

bull;利用序列、条码间隙、树形方法和分类分析等方法对识别效率进行了评价。

bull;结果表明，ITS2是钩藤属植物最适合的DNA条码。

摘要

DNA条码是一种越来越流行的物种识别手段，尽管人们尚未就DNA序列能被用作最佳植物条码的问题达成共识，但它已被广泛用于全球物种鉴定。在本研究中，我们测试了5个候选DNA条码(nrITS, nrITS2, matk, rbcL和trnH-psbA)的可行性，以鉴定钩藤属物种。我们在其分布范围内共收集了54个标本，共10个。通过对候选DNA条码的分子识别能力的研究，对其进行了序列、条码、树基方法和分类分析。结果表明，该方法最适合作为一种候选DNA条码，用于鉴定钩藤属药用植物。

1. 简介

钩藤属，属茜草科，主要分布于热带亚洲和澳大利亚。

在中国有12种。所有12种被称为“钩藤”的钩藤属物种，长期以来一直被用于中药。然而，中国药典2010版只包括5个品种，嘴叶钩藤、华钩藤、大叶钩藤、白钩藤、毛钩藤。因为在其临床效果和多用途使用中，钩藤的应用量往往很大。因此,外汇储备的主流物种明显减少，市场正变得越来越不规则，面临着诸如此类的问题。在高质量的价格下进行掺假、置换和低质量产品的销售。许多钩藤属植物形态学上相似，使得鉴定它们的起源物种困难。一种可靠快速的识别方法。为了进一步的研究和利用，需要开发出一种可靠的、快速的方法来鉴别钩藤的鉴别。

DNA条码是一种越来越流行的物种识别方法，它基于一种原理，即特定的序列散度通常比特定的序列散度低得多。该方法已成功应用于许多动物群体，作为一种高效的物种识别工具，使用了细胞色素氧化酶1(CO1)线粒体基因的一部分。与动物领域相比，建立一个标准化的DNA条码系统在植物中已经被证明是比较困难的，因为在进化历史和物种杂交方面(Kress等人，2005;Newmaster等，2006)。近年来，提出了几个不同的序列区域适用于植物的条码，包括nrITS (Kress 等，2005;蔡斯等，2005)，nrITS2 (Chen 等，2010)， matk (Lahaye等，2008)，rbcL (Kress和Erickson, 2007)和trnH-psbA (Kress 等，2005)。一些研究人员已经采用了结合位点作为植物鉴别候选人条形码序列(克雷斯,2007;蔡斯等，2007;彭尼斯,2008),但还没有任何一个普遍的共识对所有植物物种DNA条形码。对于大多数特定种类的物种来说，最合适的DNA条码必须通过测序和结果分析来选择。

我们选择了5个DNA区域(rbcL, matK, trnH-psbA, ITS和ITS2)作为DNA条形码，以评估和验证鉴定钩藤属药用植物的可行性，并为它们建立一个合适的DNA条码协议。

1. 材料和方法

2.1 分类抽样

12种植物中有10种(根据中国植物的研究，2013)植物的种类，从野外采集，个体耕种者和植物园。每个物种的多个样本(由于其有限的可用性除外)被收集，以确保涵盖了每个分类单元的形态和地理范围。样本总数为54个，所有相应的代金券样本均在中国医学科学院药用植物发展研究所(中国科学院药用植物发展研究所)的植物标本室。收集的样品的详细信息见表1。

2.2 DNA提取、PCR扩增和测序

根据制造商对植物基因组DNA试剂盒的说明(DP305, Tiangen生物技术公司，中国)，从硅胶干树叶中分离出总DNA。特异性DNA片段通过标准聚合酶链反应(PCR)扩增。Chen等人(2010)对PCR和测序的引物进行了合成，反应条件见表2。PCR扩增在20 mL反应混合物中，包含10e30ng的基因组DNA模板，1个PCR缓冲液，1.5 mM MgCl2, 0.2 mM的每个dNTP, 0.2 mM的每个引物(由生命技术合成，中国)和1.5 U Taq DNA聚合酶(DR001, Takara，中国)。PCR产物用PCR清除试剂盒(AXYGEN, USA)进行纯化，并采用PCR扩增的引物在3730XL测序仪(美国应用生物系统)上进行测序。在本研究中，我们初步测试了5个潜在的DNA条码序列，包括psbA-trnH、ITS、ITS2、matk和rbcL，但在进一步的分析过程中，由于PCR扩增效率较低，matk被省略了(见表1)。

2.3 DNA序列数据分析

为了确保测序的准确性，对原始测序结果进行了校正，并使用CodonCode一致性3.0(CodonCode Co.，USA)进行了组装。低质量的序列(根据Chen等，2010)和引物序列被删除。对于ITS2，我们使用隐马尔可夫模型(HMMs) (Keller等，2009)来去除真菌中可能被污染的序列(Keller et al.，2009)。这里提交的修改后的序列已提交给GenBank数据库，它们的加入编号列在表1中。候选DNA条码与Clustal X V2.0一致。通过使用MEGA v4.1 (Kumar等， 2008)，对输出数据进行处理，计算每个区域的Kimura-2-Parameter (K2P)距离。采用邻域法(Saitou 和 Nei, 1987)构建了系统发育树。为NJ树结构(Saitou和Nei, 1987)计算了1000个引导复制。为了比较特定的散度和内比的变化，计算平均间距离和最小的间距离，以描述特定的散度，计算出平均内部距离和聚结深度，用K2P距离矩阵来确定内部的变异，使用的软件是分类法1.0 (Meier等，2006)。物种鉴定方法最接近(Meier等，2006)。为了提高潜在条码的物种识别精度，使用GenBank DNA数据库中存储的序列数据，并在表3中列出序列名称和加入编号。需要特别注意的是，只选择了钩藤属序列的一部分，选择标准如下:(1)表1中包含了序列的分类单元名称;(2)提交日期在过去十年(2002年至2012年)之间;(3)序列的可靠性是毫无疑问的。

1. 所示结果

3.1 PCR扩增效率、测序及序列特征分析

从钩藤属的54个样本中成功提取了基因组DNA。在PCR扩增和测序后，本研究共生成了163个新序列，已提交给GenBank数据库。表1(包括54个ITS2、38个rbcL、36个trnH-psbA序列)列出了它们的可访问性。与此同时，由于PCR扩增效率较低(只有37.0%)，matk在后续分析中被忽略。表4列出了序列长度、GC比率和其他序列信息。

序列的长度从219到719个基点。最短的轨迹是，219-222 bp。每个位点的平均GC含量也不同，最高的是ITS2(达到66.2%)，最低的是psbA-trnH(含27.0%)。

PCR扩增效率和测序成功率是评价DNAbarcodes的重要指标。在我们的研究中，PCR扩增效率从高到低分别为100.0% (ITS2)、70.4% (rbcL)、66.7% (ITS)和64.8% (psbA-trnH)。对于测序的成功率，四个位点均为100.0%。基于PCR扩增和测序的效率，对钩藤属最合适的DNA条码是ITS2。

表1在本研究中研究的钩藤属植物的植物材料和凭证信息

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