谷胱甘肽依赖性聚合物前药顺式-3-（9H-嘌呤-6-基硫代） – 丙烯酸 – 接枝羧甲基壳聚糖的制备制备、表征与体外释放研究外文翻译资料

 2022-06-28 23:20:11

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谷胱甘肽依赖性聚合物前药顺式-3-（9H-嘌呤-6-基硫代） - 丙烯酸 - 接枝羧甲基壳聚糖的制备制备、表征与体外释放研究

1.引言

过去二十年来，抗代谢物6-MP已被广泛用于人类白血病和其他一些疾病的化疗。 然而，其水不溶性和与血浆蛋白（Zacchigna 等人，2007) 以及严重的骨髓和肝毒性（Gunnarsdottir 和Elfarra，1999) 限制其应用。 为了解决这些问题，一方面已经合成了一些具有alpha;，beta;不饱和键且对GSH敏感的6-MP的结构类似物。 这种前体药物，如顺式-3-（9H-嘌呤-6-基硫代） - 丙烯酸（PTA）和顺式-6-（2-乙酰乙烯基硫基）嘌呤（AVTP）可以进一步在体内代谢成6-MP（Gunnarsdottir and Elfarra，1999; Gunnarsdottir 等人， 2002). 另一方面，一些可以运载6-MP并且在特定条件下将其释放的载体也处在研究过程。

尽管如此，由于丁烯酸部分的电离和水溶性差，PTA的6-MP释放并不令人满意，而AVTP虽然对肿瘤细胞的细胞毒性增强并且小鼠的骨髓毒性降低(Gunnarsdottir 等人， 2002), 但其仍然不溶于水，而且在其转运过程中难以避免与其他物质的相互作用。对于第二种策略，即采用新型载体来转运6-MP也有其缺点，比如说其不稳定性和药物突然释放。

因此，对基于化学释放动力学的药物载体进行了研究（郑等人，2011)。在这项工作中，通过在羧甲基壳聚糖（CMCS）的NH2上接枝PTA合成了两亲聚合物前药PTA-g-CMCS。CMCS由于其优异的生物相容性，可生物降解性，无毒性和生物活性而被使用，而且注意到，该两亲聚合物具有一些特殊的物理化学性质。此外，据报导，由CMCS开发的两亲载体可以自行组装到纳米尺寸的颗粒。

另外， PTA的alpha;，beta;不饱和键对于产生6-MP具有关键作用。据报道，哺乳动物细胞中GSH的浓度比血浆（微摩尔水平）高得多（毫摩尔水平），并且癌细胞中GSH的浓度比正常细胞中的GSH浓度高4倍，这是因为癌细胞中相对较高浓度的GSH会引起alpha;，beta;不饱和键的裂解并引发6-MP的释放。本研究的目的是构建可响应GSH的纳米级药物系统。 因此，设计并合成了PTA-g-CMCS的两亲聚合物。 其自组装行为进一步研究。 最后，研究了聚合物前药对HL-60细胞系和小鼠胚胎细胞系（L929）的细胞毒性作用及其体外释放特性。

  1. 材料和方法
    1. 物料

购自玉环海洋生物化学有限公司的CMCS（分子量：2.0times;105Da，3.4times;105Da，命名为CMC的脱S1和CMCS2，其脱乙酰度为90％。通过电位滴定测定，起羧甲基取代度为0.7。（NHS），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC HCl），3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）和GSH来自Sigma-Aldrich Chemical Co.（St.Louis，MO）。6-MP和丙炔酸得自Aladdin Chemical Reagent Co.，Ltd ..所有这些材料和其他化学品都是分析试剂级的，并且在没有进一步纯化的情况下直接使用。 从中国典型培养物保藏中心（CCTCC）购买HL-60细胞和小鼠成纤维细胞系（L929），并在含有葡萄糖（4.5g / L）（补充有10％胎牛血清的意大利Euroclone）的RPMI 1640培养基（Euroclone, Italy ），青霉素（100U / mL），链霉素（100mu;g/ mL）和2mM L-谷氨酰胺。 在95％空气和5％CO2的气氛中将细胞保持在37℃。

2.2前药PTA的制备

PTA按照Turbanova等人的方法合成。将6-MP（1.83g，12mmol）分散在80mL无水甲醇中。 此后，在连续搅拌下加入甲醇钠（2.38g，44mmol），直至6-MP完全溶解，随后引入丙炔酸（0.84g，12mmol）。 连续搅拌反应混合物过夜（15-18小时）并通过加入40mL去离子水淬灭。 为了回收粗产物，向混合物中加入HCl（1M），并沉淀产物如白棉花。 连续加入HCl直至不再有沉淀出现。 通过过滤收集沉淀，通过加入NaOH（1M）重新溶解，并通过加入HCl（1M）重新沉淀。 通过过滤收集纯化的产物，然后真空干燥。 粉碎后，PTA在4℃下保持空气不足。 随后用熔点仪测量PTA的熔点。

2.3.聚合物前药PTA-g-CMCS的合成

在连续搅拌下将CMCS（2.5g）溶于100mL去离子水中直至粉末完全溶解。 将PTA（3.0g在5mL无水二甲基亚砜中）溶液与3.42g EDC·HCl和0.95g NHS反应3小时以形成NHS酯（n氨基：nPTA：nEDC：nNHS= 1：1：1：0.3）。 然后将其逐滴加入前CMCS溶液中，并将反应体系在室温下搅拌72小时。 将反应混合物针对DMSO透析（MWCO 14,000）24小时以除去副产物和过量的反应物，然后针对去离子水处理24小时以去除盐。 将透析液冻干以获得生产产品。 所得产物命名为PTA-g-CMCS2,对应于所用的CMCS。

2.4.PTA和PTA-G-CMCS的表征

傅里叶变换红外光谱仪（Ava-tor360，Nicolet，MA，USA）用于测定PTA和PTA-g-CMCS的官能团。 作为对照，还制备了6-MP和CMCS的样品。

11H NMR：11H NMR谱在Bruker DPX300光谱仪上记录。CMCS和PTA-g-CMCS能溶解在D2O。 通过1H NMR计算PTA的取代度（DS），同时通过元素分析对PTA的DS进行补充估计。

2.5.制备PTA-g-CMCS纳米粒子

将PTA-g-CMCS分别溶于磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）和乙酸盐缓冲液（pH5.6）中，连续磁力搅拌以形成1mg / mL的溶液。 然后用探针型超声波仪（JY92-2D，中国宁波科技生物技术有限公司）以100W超声处理4分钟。 为了保护溶液免受热量累积，使用脉冲功能（脉冲开启，2.0秒;脉冲关闭，2.0 s)。

2.6纳米粒子的表征

临界胶束浓度（CMC）：两亲性PTA-g-CMCS在水性介质中的胶束行为在芘作为荧光探针的存在。制备含有1times;10-6M芘的一系列PTA-g-CMCS1和PTA-g-CMCS2溶液。 样品浓度从3.0times;10minus;6变化到3.0mg / mL，激发波长（lambda;ex）为335nm。

尺寸分布和zeta;电势：使用Zetasizer Nano-ZS ZEN3600（MALVERN仪器）通过动态光散射测量PTA-g-CMCS（1mg / mL）纳米颗粒的平均流体动力学直径和zeta;电势。 所有的测量都是在25℃下进行并重复三次。

透射电子显微镜（TEM）：TEM（JEM-100CX11，JEOL）用于观察制备的纳米颗粒的形态。 将一滴样品（1mg / mL）置于碳涂覆的铜网上并在室温下进一步干燥10分钟。 所有样品均未染色。

2.7.体外药物释放研究

药物释放实验在37℃进行。简言之，将PTA-g-CMCS（4.5mg）在4.5mL缓冲液中的溶液在透析管中透析。 然后将透析管浸入含有不同浓度GSH的培养基中。 没有GSH的培养基被用作对照。 在每个特定时间间隔，取出20mu;L释放介质以通过HPLC测量。

使用各种浓度的GSH（2mu;M，100mu;M，1mM，2mM，10mM）研究其GSH依赖性释放动力学，同时使用两种缓冲液（PBS 7.4和乙酸盐缓冲液5.6）模拟血管中的不同微环境和癌细胞。 同时，还研究了药物含量对释放特性的影响。

2.8 MTT测试

将HL-60细胞以1/104细胞/孔的密度接种到96孔微量滴定板中。 24小时后，用完全培养基中的100mu;L/孔系列稀释的样品代替培养基。 将细胞暴露于游离的6-MP（浓度从4.2至21mu;g/ mL变化），PTA-g-CMCS1（浓度范围为50-250mu;g/ mL）和GSH活化的PTA-g-CMCS1（浓度范围从用2mM GSH50-250mu;g/ mL）处理48小时。 然后通过离心（2000rpm，5分钟）除去培养基。另外单独将MTT以5mg / mL溶解于磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，并将100mu;L最终浓度为0.5mg的MTT / mL的不含FBS的RPMI1640加入各孔中。 4小时的孵育期后，将样品离心（2000rpm，5分钟）以除去未反应的染料。 将紫色显色剂溶解于100mu;L/孔DMSO中，并通过酶标仪（BIO-TEK，USA）在490nm处定量。 通过(ODcontrol minus; ODtest)/ODcontrol times; 100计算含有和不含样品的对照孔的相对细胞抑制率（％）。数据全部显示空白组没有HL-60细胞。

同时使相同的方法进行PTA-g-CMCS1对小鼠胚泡细胞系（L929）的细胞毒性。 细胞在含有游离6-MP的培养基中培养（浓度范围从4.2到21mu;g/ mL）和PTA-g-CMCS1（浓度范围从50到250mu;g/ mL）。将不含药物的培养基设为对照组通过(ODcontrol minus; ODtest)/ODcontrol times;100计算相对细胞抑制率（％）。所有数据证明空白组缺少小鼠胚胎细胞系（L929）。

3. 结果与讨论

Fig. 1. (A) Synthesis of PTA, (B) synthesis of PTA-g-CMCS, (C) 6-MP release from PTA-g-CMCS in the presence of glutathione (GSH), which follows a Michael addition–elimination reaction: GSH attacks the -C of the unsaturated bonds, leading to the cleavage of the unsaturated bonds

3.1 PTA-g-CMCS的合成与表征

在EDC HCl和NHS的催化下，将PTA接枝到CMCS的伯氨基上。 更具体地说，整个反应采取以下两个步骤：合成PTA（图1A）和PTA-g-CMCS（图1B）。 最初，PTA是由6-MP和丙炔酸合成的，它在分子中引入了一个双键。 经熔点仪测试，我们制备的PTA熔点为236℃，与（Gunnarsdottir 和Elfarra，1999)报告相一致。 在以下步骤中，在EDC HCl和NHS的催化下，将PTA接枝到CMCS的NH2上。 在此反应中，PTA的羧基首先被活化，然后通过碳化二亚胺化学接枝到CMCS上。 PTA-g-CMCS的产率在48和61％之间，并且溶解度测试显示它可以容易地溶解在pH范围为5.0-8.0的含水缓冲液中。 通过FT-IR和1H NMR对PTA和PTA-g-CMCS的化学结构进行了表征。

6-MP，PTA，CMCS和PTA-g-CMCS的FT-IR光谱显示在图2。6-MP在3440cmminus;1（NH，拉伸），2670cmminus;1（SH，拉伸），1610cmminus;1（酰胺I带）具有特征峰，嘌呤环的特征带在795-1cm和478cm-1之间，也在6-MP谱中观察到。

PTA的特征峰在3470cmminus;1（与NH拉伸重叠的OH拉伸带），3080cmminus;1（CH拉伸），1680cmminus;1（酰胺I带）。795-478cm-1（嘌呤环）的峰。与6-MP相比，在3500-3300cmminus;1和1680-1600cmminus;1处增加的PTA强度以及在2670cm-1下降的强度指示6-MP与丙炔酸之间的连接，这说明了PTA的成功合成。

CMCS的特性显示为3500-3200cm-1（-OH伸展带和-NH拉伸重叠），1632cm-1和1411cm-1（COC-对称与反对称拉伸），1060cm-1（吡喃环COC伸缩振动）。与CMCS相比，PTA-g-CMCS在在3400cmminus;1处的强度增加以及在3080cmminus;1处出现的峰表明PTA在CMCS上成功连接。与PTA相比，PTA-g-CMCS在3080cm-1处的强度下降也证明PTA-g-CMCS被成功合成。

给出了CMCS1和PTA-g-CMCS1的1H NMR如图3。 CMCS1的质子分配如下（ppm）：2.107（COCH3），2.345（H2），3.3-3.9（H3，H4，H5，H6），4.460（H1），

据报道，PTA的化学位移（Gunnarsdottir 和 Elfar

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