联合疗法的局部癌症治疗外文翻译资料

 2022-07-19 20:41:14

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摘 要

联合疗法的局部癌症治疗因其能有效抑制肿瘤生长，已经引起越来越多关注。在这项工作中，我们引入了DMR肿瘤靶向效应这一种新的策略，即使用转铁蛋白（Tf）修饰的中空介孔CuS纳米粒子（HMCuS NPs）在肿瘤周围（PT）注射。在这里，具有强烈的近红外（NIR）吸收和光热转换效率的HMCuS NPs不仅可以用作药物载体，而且可以用作强力造影剂用于光声成像以指导化疗 - 光疗。对肿瘤细胞具有强烈的细胞毒性的铁依赖性青蒿琥酯（AS）被用作模型药物。因此，这种AS负载的Tf-HMCuS NPs（AS / Tf-HMCuS NPs）系统可特异性靶向肿瘤细胞并同时将AS和铁递送到肿瘤中以实现增强的抗肿瘤活性。发现AS / Tf-HMCuS NPs被MCF-7细胞通过Tf介导的内吞作用吸收，并且可以有效地将NIR光转化为热用于光热疗法以及产生高水平的用于光动力学的活性氧（ROS）治疗。此外，体内抗肿瘤疗效研究在NIR激光照射下通过瘤周（PT）注射AS / Tf-HMCuS NPs的荷瘤小鼠即使施用次数减少也显示出最强的抑制率约74.8％。此外，为了证明DMR，PT注射后的光学成像，光声层析成像和免疫荧光被用于追踪AS / Tf-HMCuS NPs 的体内行为。结果表明，Tf-HMCuS NPs延长局部积累和滞留以及缓慢的血管摄取和广泛的间质扩散，这与AS / Tf-HMCuS NPs 的生物分布研究一致。因此，通过结合多机制治疗的DMR局部递送途径可能是用于癌症治疗的有前途的方法。

意义:近年来，使用不同生物材料的局部癌症治疗越来越受到有效抑制肿瘤生长的关注。然而，对于这种系统来说，实现高载药量，克服注射部位到作用部位的生物屏障，并将协同治疗与诊断相结合，而不会对形成过程产生不利影响仍然是具有挑战性的。该研究提供了基于中空介孔硫化铜的局部扩散分子保留（DMR）肿瘤靶向药物递送系统纳米粒（HMCuS NPs）首次包埋抗癌药物，可实现高载药量，改善局部药物蓄积和滞留，实现化疗光疗的协同组合，最终提高抗肿瘤作用。此外，HMCuS NPs还拥有适合光声成像的特性，可为我们提供一个理论上的平台。

1.绪论

癌症是世界各地的主要公共卫生问题，目前，标准的临床治疗包括手术和全身多药化疗。然而，大多数化疗药物的全身给药只能将有限量的药物递送到肿瘤部位，并且通常导致短期和长期副作用。因此，既提供肿瘤物理靶向又提供药物控制释放的局部给药系统可改善患者预后并可能克服与全身给药相关的限制。

在过去的几十年中，注射用热敏水凝胶作为局部抗肿瘤药物递送的有希望的方法受到越来越多的关注。尽管如此，这种系统实现高载药量，克服注射部位到作用部位的生物屏障，或将载有药物的颗粒截留到水凝胶中而对形成过程没有不利影响是具有挑战性的 。尤其是，递送障碍涉及在肿瘤部位累积，深入肿​​瘤间质，癌细胞内化和细胞内药物释放。为了解决上述问题，我们在工作中引入了由李约瑟逊教授提出的称为扩散分子滞留（DMR）肿瘤靶向的技术。通过使用瘤周（PT）给药，DMR可以通过缓慢的血管摄取和广泛的间质扩散来绕过静脉（IV）施用遇到的递送障碍。

在这里，我们使用中空介孔CuS纳米粒子（HMCuS纳米粒子），由于它们均匀的孔结构和高的药物包封表面积，它们被认为是比固体纳米粒子更优越的智能载体，作为局部药物递送的载体。此外，据报道，CuS不仅可以用作光热治疗的光敏剂，而且还可以在NIR照射下产生用于光动力治疗（PDT）的细胞毒性活性氧（ROS）。由于协同作用，该系统可以在较低的药物剂量和温和的照射条件下实现增强的抗肿瘤效力。重要的是，CuS也拥有适合光声成像的特性，这可以帮助我们在PT注射后观察DMR。

虽然在概念上令人印象深刻，但HMCuS NPs仍然缺乏对肿瘤部位的主动识别能力，并且在应用药物释放之前应该解决药物过早释放。众所周知，转铁蛋白受体（TfR）在恶性组织中表达更多，转铁蛋白（Tf）可能潜在地用作肿瘤检测的细胞标志物。Tf-TfR相互作用已被用作细胞摄取药物和基因的潜在有效途径。因此，在我们的研究中，Tf锚定在HMCuS NPs的表面上作为靶向分子。更重要的是，它还可以通过在HMCuS NPs周围形成致密层来担当看门人的角色，负责减少过早药物释放。

最重要的是，Tf可以转运铁，这是细胞生长的重要调节剂。同时，已经发现青蒿琥酯（artesunate，AS）是青蒿素的部分合成衍生物，其在体外和体内对肿瘤细胞具有显着的细胞毒性。关键的抗肿瘤机制被认为是铁介导的内过氧化物桥的切割和毒性自由基的形成也就是说，AS可以被细胞内的铁激活，并且Tf和AS与癌细胞的共同递送是增强AS的抗癌活性的有吸引力的策略。考虑到Tf和AS的特点，我们选择AS作为本研究的模型药物，可以通过Tf-TfR相互作用选择性积累在癌细胞中。在胞吞作用后，从Tf释放的铁很容易与AS反应形成自由基，导致细胞死亡。

在这项研究中，我们首次假设了基于纳米载体包埋抗癌药物的局部DMR肿瘤靶向药物递送系统（图1 ），其可以实现高载药量，改善局部药物积累和保留，实现化疗的协同组合 - 光疗，最后增强抗肿瘤作用。为了证明概念，使用TEM，荧光光谱和紫外 - 可见（UV-VIS）光谱仪制备和表征AS负载的Tf修饰的HMCuS NP（AS / Tf-HMCuS NPs）。通过光学成像，光声层析成像和免疫荧光技术研究PT注射体内设计系统后DMR肿瘤靶向效应。此外，体外和体内评估了细胞毒性，受体介导的肿瘤靶向特征和协同抗癌功效。

2 .实验部分

2.1 .化学制品

青蒿琥酯（AS）（纯度gt; 99.0％）购自上海瑞永生物技术有限公司。从SigmaeAldrich（St Louis，MO，USA）获得转铁蛋白（Tf）（纯度gt; 98％），异硫氰酸荧光素（FITC），罗丹明6G，磺基罗丹明B （SRB）和二甲基亚砜（DMSO）。PVPK30（MW = 30000）购自Solarbio Science＆technology Co.，Itd。从北京凡博生物化学股份有限公司购买 1,1#39;-双十八烷基-3,3,3#39;，3#39;-四甲基吲哚三羰花青碘化物（DiR）（纯度gt; 99％）。抗CD31抗体购自Abcam（UK） ，荧光素偶联的AffiniPure山羊抗兔IgG得自ZSGB生物技术有限公司（中国北京）， DAPI Fluoromount-GTM购自上海易盛生物科技有限公司。所有动物实验均遵照机构动​​物护理和使用委员会进行。

2.2 .AS / Tf-HMCuS NPs的制备

HMCuS NPs按照我们以前的研究报道进行制备。简言之，首先将聚（乙烯基吡咯烷酮）（0.24g ）溶于 25mL去离子水中，然后在室温搅拌下滴加CuCl 2溶液（ 100mu;L， 0.5mol / L）。随后，加入NaOH（ 25mL，0.02mmol / L）以及中度的肼无水溶液以形成Cu 2 O纳米球，并且化学计量的Na 2 S与上述溶液混合。在60℃下搅拌2分钟后， h，收集产物（HMCuS NPs）并通过用去离子水洗涤几次来纯化。最后，将得到的产物真空冷冻干燥过夜。

对于AS负载， 将溶于乙醇的游离AS（5mg / mL）与HMCuS NPs（ 1mg / mL）在PBS中混合。然后使用超声波细胞破碎系统（250W ，15次）在冰浴条件下超声处理该混合物。随后，将该溶液磁力搅拌24 小时。为了去除残留的游离AS，将纳米悬浮液通过透析袋（分子量截留值 = 3500）透析 12 小时。

在制备AS / HMCuS NPs之后，如下进行Tf加帽。将溶于PBS缓冲液中的 Tf（1mg / mL）逐滴加入到AS / HMCuS NPs纳米悬浮液中，并将混合物在室温下搅拌24小时。作为结束，通过以12,000r / min离心10 分钟收集所得产物（AS / Tf-HMCuS NPs），并用去离子水洗涤三次以除去未修饰的Tf。由于TF与HMCuS的NP结合可能会导致自体荧光猝灭 TF（lambda;ex的 = 280 纳米，lambda;em = 332 nm）的，最佳组合比可被确定，而TF的最大荧光猝灭发生 。制备不同浓度0,10.0,20.0,30.0和40.0mu;g / ml的HMCuS NPs并分别加入到Tf溶液（10.0mu;g / ml）中。此后，HMCuS NPs和Tf之间的相互作用由荧光光谱表征（Shimadzu，Tokyo，Japan）。随着浓度的增加，记录荧光光谱以确定最佳结合比率。因此，所得的AS / Tf-HMCuS NPs在4℃下储存直至使用。也用与对照相同的方法制备不含AS负载的Tf-HMCuS NPs。

2.3 .表征

使用ZetaSizer Nano系列Nano-ZS（Malvern Instruments Ltd，Malvern，UK）通过动态光散射（DLS）测定平均尺寸和zeta;电位。用透射电子显微镜（TEM）（Tecnai G2 20，FEI）观察HMCuS NPs，Tf-HMCuS NPs和AS / Tf-HMCuS NPs的形态。使用UV-Vis分光光度计（Lambda 35，Perkin-Elmer，USA）测量NP的消光光谱。另外，HMCuS NPs和Tf之间的相互作用由荧光光谱表征（Shimadzu，Tokyo，Japan）。

2.4 .测定Tf-HMCuS NPs上的AS负载量和从AS / Tf-HMCuS NPs释放的AS负载量

如下测定纳米颗粒中AS的量。首先，使用3mL 二氯甲烷提取AS / Tf-HMCuS纳米悬浮液中的AS负载，在氮气流下干燥并在200mu;L乙醇中重构。在此之后，将溶液用2水解毫升0.2％的NaOH在50 plusmn; 1 ℃下进行30 分钟，然后冷却至室温并调节pH值以1.6 毫升的乙酸（0.08 M），以形成作为衍生物与稳定的结构（衍生物的特征UV吸收峰：260nm ）。最后，通过高效液相色谱测量AS的浓度（HPLC，沃特斯e2695，USA）与以下条件：aSymmetryreg;C18柱（150 毫米 times; 4.6 毫米，5.0 微米）; 流动相：甲醇：0.01M 乙酸钠 - 乙酸缓冲溶液（pH = 5.8）62:38（v / v）; 柱温，30 °C; 检测波长260nm ; 流速1.0 mL / min，进样量20mu;L 。

AS溶液，AS / HMCuS NPs和AS / Tf-HMCuS NPs的释放曲线通过透析方法评估。简而言之，将样品放入透析袋（分子量截留值 = 3500）并密封。然后，将它们浸入 50mL 20％乙醇缓冲水溶液（乙醇：PBS，v / v = 1：4）中，并在搅拌速度为100r的水浴中在37.0 plusmn; 0.5 ℃ 温和振荡/分钟。在不同的时间点抽取释放样品（0.2mL ），并用相同体积的水性缓冲溶液代替培养基。在上述条件下通过HPLC定量AS / Tf-HMCuS NPs释放的AS的浓度。

2.5 .NIR激光照射下的光热效应

使用连续波NIR激光（808nm ）照射，以 2W / cm2的辐射能量测定不同浓度（HMCuS浓度：0-200mu;g / mL）的HMCuS NPs和Tf-HMCuS NPs在PBS中的光热转换效率。厘米2。用红外温度计（HT-8878，郑州金阳光仪器有限公司）检测温度并以30 秒为间隔记录。

2.6 .AS / Tf-HMCuS NPs的体外抗肿瘤作用

2.6.1 .细胞摄取

使用荧光显微镜和流式细胞术 检查细胞摄取。首先，将MCF-7人乳腺癌细胞以每孔3.0 times; 10 5个细胞的密度接种在培养载玻片上，并在6孔板中培养24 小时以使细胞附着至孔表面。将异硫氰酸荧光素（FITC）（一种荧光探针）结合到HMCuS和Tf-HMCuS中以观察它们的细胞内摄取行为。根据以下方法通过将样品与FITC混合来加载FITC：将在DMSO中的FITC（ 1mg / mL， 200mu;l）加入到HMCuS NPs（3.0 mL）并用超声细胞破​​碎系统超声处理。Tf的接合方法与AS / Tf-HMCuS NPs的制备相同。通过Sephadex G-25柱（SigmaeAldrichCo.LLC）除去过量的FITC 。

随后，分别用FITC，FITC / HMCuS NPs和FITC / Tf-HMCuS NPs（HMCuS浓度： 20mu;g/ ml）处理MCF-7细胞0.5 小时，1 小时和2 小时。在指定的时间点，用PBS洗涤细胞三次并用4％多聚甲醛固定20 分钟。最后，将样品固定在Dako荧光固定介质中，并在荧光显微镜下观察（LSM 510，德国蔡司）。

另外，细胞样品也如上所述进行指定的时间段（0.5,1或2 小时）。所有细胞样品用PBS洗涤，通过胰蛋白酶消化收集，通过离心收集并悬浮在PBS缓冲液中用于流式细胞术分析。详细的方法见于SI。

2.6.2 .体外细胞毒性研究

进行SRB染料还原测定以量化本研究中设计的纳米颗粒的细胞毒性。在典型的过程中，将MCF-7细胞以每孔3 times; 10 5个细胞接种在96孔板中并培养24 小时，然后与含有不同HMCuS NPs制剂，AS / HMCuS NPs，AS ，AS-Tf和AS / Tf-HMCuS NP（AS浓度： 20mu;g/ mL和HMCuS NPs浓度： 100mu;g/ mL）。然后 用功率密度为 2W / cm 2的808nm 连续波NIR激光器照射或不照射细胞5 分钟。之后，将细胞在37 ℃ 下再温育24,48和72℃ H。在温育时间结束时，进行标准SRB测定以测量给定时间间隔的细胞活力。

2.6.3 .细胞内活性氧（ROS）检测

由于AS和HMCuS的抗肿瘤机制都与ROS有关，我们检查了细胞中产生的ROS的程度。使用DCFH-DA活性氧物种测定试剂盒检测细胞

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