分解酶介导的细菌降解蒽的研究外文翻译资料

 2022-08-06 09:39:38

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分解酶介导的细菌降解蒽的研究

摘要：此项研究对从石油烃污染土壤中提取的铜绿假单胞菌PSA5、红球菌sp.NJ2、坂崎肠杆菌sp.PSM10三种细菌菌株的在极低盐介质（MSM）中降解高浓度蒽的能力进行了评估。PSA5的最大降解率可达94% ，其次是PSM10 (84%) ，培养10天后NJ2 的降解率最低 (78%) 。研究了分解酶C120、C230、3, 4-PCD和4, 5-PCD的比活性，实验表明这些菌株通过邻苯二甲酸盐途径使蒽矿化。然而，铜绿假单胞菌PSA5和阪崎肠杆菌sp.PSM10对蒽的芳环的裂解主要通过邻位裂解途径，而红球菌sp.NJ2则是通过间位裂解裂解蒽的芳环。这些菌株在蒽降解过程中产生的生物表面活性剂也通过培养基表面张力的降低和24 h 内苯的乳化作用得到证实。

关键词：蒽；细菌；生物降解；生物表面活性剂；降解酶类

前言

多环芳烃 (简称PAHs) 是一种普遍存在于空气、水和土壤中的有机污染物。多环芳烃由于其难降解性而长期存在于环境中，从而在生物体内积累，并导致各种健康风险。1美国环保局 (Wattiau, 2002) 将包含蒽在内的十六种多环芳烃 (C14H10) 列为主要污染源，主要原因就是它们的致癌性和致突变性。同时，据报道，生物体内多环芳烃的代谢物可以结合并破坏DNA和RNA，导致肿瘤的形成。2据报道，燃料油 (300mg L-1) 中含有较高浓度的蒽，包括印度在内的全球它都被用作荧光材料、木材防腐剂、杀虫剂、农药、包衣材料塑料等。包括印度。在印度，即使是中央污染控制委员会（CPCB）也经常报道在新德里的环境空气中存在蒽。3因此，它经常被各种研究人员用来进行降解研究。

与物理化学方法相比，微生物降解具有自驱动、经济有效和生态友好等优点，可用于多环芳烃污染土壤的修复。6，7有许多关于大自然中通过细菌、真菌、藻类微生物降解多环芳烃的报道，在这些细菌中，阿拉伯半乳糖酵母菌、兽舌苔癣菌、回肠副球菌、嗜碱地衣芽孢杆菌（MTCC 5574）、嗜麦芽窄食单胞菌AJH1（KU664513）和反硝化阿利西环杆菌已经被报道与蒽降解有关。10-12最近，Tarafdar等人13从粉煤灰沉积场分离到一株苏云金芽孢杆菌，并且发现此菌经培养2周后能降解91%的40 mgL -1的蒽，而对嗜碱地衣芽孢杆菌 (MTCC 5574) 经培养22天后降解率gt; 300 ppm的95%。12然而，Bauer和Capone，14以及Sadighbayan等人15报告的蒽的生物降解浓度高达1000 ppm。

细菌诱导酶，尤其是氧化还原酶，在多环芳烃降解过程中起着重要的作用。它们进行了多环芳烃分子的裂变，并允许这些分子进入微生物细胞中常见的能量生产途径和碳排放途径。16在蒽/石油烃降解过程中，细菌诱导邻苯二酚1, 2双加氧酶和原儿茶酚3, 4双加氧酶等邻位裂解酶，和(或)邻苯二酚2, 3双加氧酶和原儿茶酚4, 5双加氧酶等间位裂解酶决定了它们的矿化途径。

由于多环芳烃存在疏水特性，导致微生物对其的生物利用率较低。而微生物诱导的生物表面活性剂由于含有疏水基（脂）和亲水基（糖或蛋白质），能通过降低表面/界面张力19，提高多环芳烃的溶解度17，18和生物利用度，从而促进多环芳烃的降解。已有不同研究者观察到了生物表面活性剂诱导作用与疏水化合物的生物降解之间的直接关系。20，21

本文研究了三种细菌 (PSM 10、NJ2和PSA5) 对在体外浓度高达1000ppm的蒽的降解，结果表明，三种细菌在体外对蒽的降解速率高达1000 ppm。通过对7株已知石油烃类降解菌的筛选(耐受能力) ，确定了该细菌株和蒽的浓度。在我们过去的研究中，这7株细菌菌株已经证明了它们能够降解不同的石油烃类，如芘、荧蒽、二十六烷等。22，23，21，24同时，还分析了分解代谢酶邻苯二酚双加氧酶和原儿茶酸双加氧酶的参与情况，以确定蒽的降解途径。此外，还研究了细菌产生的生物表面活性剂在蒽降解过程中的作用和表征。

材料和方法

材料

从Sigma Aldrich采购蒽、邻苯二酚、叶黄素和二氯甲烷 (高效液相色谱级)，从Fisher Scientific Pvt. Ltd.采购Na2HPO4、NaH2PO4、EDTA、NaOH、酒石酸钾铵、CuSO4.5H2O、己烷、苯等。所有培养基如不含葡萄糖的微量盐培养基 (MSM) 、营养琼脂培养基 (NA) 和营养肉汤 培养基(NB) 均采购自Himedia。

细菌筛选

采用富集法从马图拉炼油厂、美国石油公司和巴拉尼炼油厂收集的不同石油烃类污染土壤/石油污泥中分离出7株降解碳氢化合物的细菌，在MSM琼脂平板上培养，并添加不同浓度的蒽 (100,200、500和1000 ppm) 。筛选出三株能长至1000 ppm的强力菌株，进行进一步研究。

实验装置

蒽的生物降解

为了研究蒽 (1000micro;gmL-1) 的降解，首先将溶于2 mL DCM中的20 mg蒽倒入每100 mL锥形瓶中，避光放置6 h ，蒸发除去DCM。每个烧瓶中分别倒入20 mL MSM肉汤，用密闭的棉塞封闭，然后在高压灭菌器中灭菌。室温冷却后，3株细菌(在营养肉汤 (NB) 1000 ppm蒽中培养)的1 mL活性接种物 (1*106 CFU mL-1) 分别在层流气流中接种。以无接种物的MSM为对照，观察非生物因素（包括蒸发）对蒽的还原作用。所有处理分两组进行，每组重复3遍;其中一组用于降解试验，另一组用于细菌生长、蛋白质诱导、酶的比活性、pH值、表面张力和培养基乳化指数等参数的分析。所有烧瓶在37 ℃、150 rpm的振动筛中培养10天，并从培养日起每隔2天采集样本。

采用液-液萃取法 (1:1 v/v，介质为二氯甲烷)从MSM中提取残留蒽。该过程重复三次，分离有机层，用无水硫酸钠过滤，并合并在同一烧杯中。萃取剂被浓缩，最后在1mL乙腈中制备。采用反相高效液相色谱法，以紫外检测器 (254nm)和C18流动相 (5mu;m，250*4.6mm)分析样品。采用水/乙腈(50:50-15:85v/v)梯度流动相，注入流速为1.5 mL/min。用该公式测定生物降解效率 (BE) ，其中As =各样品的峰面积，Aac =无细菌培养的峰面积。

BE(%) = (Aac minus; As)/Aac times; 100

生物降解动力学

生物降解动力学决定了目标化合物的降解速率。降解曲线的形状提供了有关降解模式的宝贵信息。在一级动力学中，化合物的生物降解速率与其浓度成正比。采用一级动力学模型测定了三株细菌（PA5、PSM10和NJ2）对蒽的降解速率，并通过如下公式计算得出：

Ct= Cominus;kt

其中，Co为初始底物浓度，Ct为t时刻的剩余底物浓度，k为生物降解速率常数（day-1），t为衰变时间（2天间隔）。

绘制了底物浓度与时间的对数图，以显示蒽的生物降解模式。在生物降解过程中，蒽的半衰期计算公式如下：

t1/2= ln2/k

其中，k为生物降解速率常数（day-1）。

细菌生长

在降解期（10天）内，每隔2天用紫外可见分光光度计 (PerkinElmer Lambda 35) 以600nm（OD600）的吸光度为基础，测定了三株细菌 (PSA5、NJ2和PSM10) 在加入1000ppm蒽的MSM中的生长情况，23细菌的比生长率按如下公式计算：

Speciflc growth rate(mu;) = dx/xo.dt

其中，dx =培养基在t时刻OD值的变化；Xo =接种后的培养基的即刻OD;dt =时间间隔。

培养基的pH值

同时用pH计(Orion EA940)监测含有细菌细胞的MSM培养基在蒽降解 (1000ppm) 过程中的pH值。

蛋白质估算

为了提取细菌蛋白，在4 ℃下以8000 rpm离心10 min，从10 mL样品中提取细菌细胞。收集的细菌细胞用磷酸钾缓冲液 (pH=7) 洗涤2次，然后重悬于相同的缓冲液中，超声处理5 min。在4oC下以20000 rpm离心25分钟从缓冲液中分离细胞碎片。采用Lowry等人的方法测定细菌蛋白25 ，并利用紫外-可见分光光度计在660 nm处绘制了牛血清白蛋白 (BSA) 的蛋白标准曲线。

氧化还原酶的测定

为了解蒽的降解途径，采用分光光度计测定邻苯二酚1, 2双加氧酶 (C12O) 、邻苯二酚2, 3双加氧酶 (C23O) 、原儿茶酚3, 4双加氧酶 (3, 4 PCD) 和原儿茶酚4, 5双加氧酶 (4，5-PCD) ，在不同lambda;max（260 nm、345 nm、290 nm和410 nm）条件下，培养3分钟后的提高的反应混合物的吸光度。并通过提高反应吸光度的方法对其进行了研究。C12O的反应混合物含有1micro;mol EDTA、0.1micro;M邻苯二酚作为底物、8.7micro;M磷酸钠缓冲液 (pH 7.0) 和细胞提取物 (0.02–0.06mg蛋白)，而C23O的反应混合物含有48micro;M磷酸钠缓冲液 (pH 7.5) 、0.1micro;M邻苯二酚作为底物和细胞提取物 (0.02–0.06mg蛋白)，最终体积为1mL。26为了分析P340和P450的比活度，1mL的反应混合物以20 mu; L的原儿茶酸（50 mM）为底物，960mu;L的Tris-HCl缓冲液pH7.4（50 mM）和20mu;L的提取细菌蛋白，但分别在290nm27和410nm28的不同波长下观察。

生物表面活性剂的制备及其表征

采用Rahman等人的方法对细菌菌株产生的生物表面活性进行测定。将含1000 ppm蒽的锥形烧瓶 (250 mL) 置于150 mL MSM中进行灭菌，然后分别接种细菌培养物 (PSA5、PSM10和NJ2) ，并置于37 ℃和150 rpm的振荡器中培养2周。培养2周后，将培养液以8000 rpm，4°C离心15 min ，分离上清液，弃去颗粒。将上清液用6 N HCl酸化至pH = 2，在4 ℃冰箱过夜沉淀。收集粗沉淀物，将酸化溶液在4 ℃和8000 rpm离心15 min。随后将其溶解于0.1 M NaHCO3中，用等体积的氯仿和甲醇 (2：1 v/v) 涡旋萃取。用分液漏斗分离法分离含有生物表面活性剂的有机相。

生物表面活性剂的部分试验

将2滴20% alpha;-萘酚溶液(乙醇溶液)加入到含2 mL生物表面活性剂溶液的试管中，混匀。将约2 mL浓H2SO4倒入管侧面，在两相间形成环状，表明存在糖部分。30用茚三酮检测生物表面活性剂中的蛋白部分。在本试验中，将5滴0.2%茚三酮溶液（丙酮溶液）加入到置于试管中的2 mL生物表面活性剂溶液中，并在80至90 ℃的水浴中加热2分钟。冷却后，出现蓝色，这证实了蛋白质的存在。31为证实生物表面活性剂中存在脂质，将生物表面活性剂和水以1:1的比例在试管中混合，轻轻摇动。然后加入2%苏丹Ⅲ染色液(乙醇溶液) 3滴，上清液上表面形成红色色层，显示出2013年Mishra等人所描述的脂质部分。26

培养基表面张力 (ST)

细菌生产的生物表面活性剂具有降低表面界面张力的作用。因此，通过测定ST的减少来证实生物表面活性剂在降解过程中的诱导作用。通过离心样品，分离无细胞的水介质。在室温25 ℃下，以蒸馏水相对密度为标准，采用滴重计和相对密度（r.d.）法测定介质的表面张力。用滴重计测定介质的表面张力。它是用下列公式计算的：

gamma;m= (nwtimes; dmtimes; gamma;w)/(nmtimes; dw)

其中gamma;m和gamma;w为介质和蒸馏水的表面张力 (71.99mN/m), dm和dw为介质和蒸馏水的25 mL重量，nw和nm为通过滴重计测定固定体积的介质和蒸馏水滴数。

乳化指数 (EI) 和乳化稳定性 (ES)

采用Hassanshihian等人的方法，在蒽降解过程中，测定了三种细菌细胞在培养基中产生的生物表面活性剂的EI。32将各个细菌的无细胞悬液(培养基)与等量苯在圆柱形平板培养管中混合，涡旋2 min ，静置24 h。培养24小时后，测定乳化层，并按照如下公式计算EI：

Emulsiflcation Index(%) = Height of Emulsifled layer/Tot a l heig h

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