一种不依赖于突变的CRISPR-Cas9介导的基因靶向方法来治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的小老鼠模型外文翻译资料

 2022-08-07 14:15:08

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一种不依赖于突变的CRISPR-Cas9介导的基因靶向方法来治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的小老鼠模型

Lili Wang 1*, Yang Yang1,2*, Camilo Breton1, Peter Bell1, Mingyao Li3, Jia Zhang1 , Yan Che1,Alexei Saveliev1, Zhenning He1, John White1, Caitlin Latshaw1, Chenyu Xu4, Deirdre McMenamin1,Hongwei Yu1, Hiroki Morizono4, Mark L. Batshaw4, James M. Wilson1

摘要：

鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺乏症是与高死亡率相关的X连锁尿素循环障碍。尽管对于晚期发作的OTC缺乏症有希望的治疗方法，但是腺相关病毒（AAV）新生儿基因治疗只能提供短期治疗效果，因为非整合基因组会在肝细胞增殖过程中丢失。CRISPR-Cas9介导的同源性定向修复可以纠正新生 spfash灰小鼠肝脏中10％的OTC等位基因的G到A突变。然而，能够纠正一个突变的编辑载体不适用于携带不同OTC突变的患者，而且表达速度不足以治疗高氨血症危机。在这里，我们描述了一个双重AAV载体系统，该系统可从非整合小基因实现快速短期表达，并从该小基因的位点特异性整合实现长期表达，而对新生儿OTC阳性细胞没有任何选择性生长优势。这种CRISPR-Cas9基因靶向方法可能适用于所有OTC缺乏症患者，无论其突变和/或临床状态如何。

1引言

鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺乏症（OTCD）是X连锁隐性疾病，几乎占尿素循环所有先天性错误的一半[1]。新生儿时期严重的OTCD会导致高氨血症昏迷，如果不进行治疗，它会迅速致死[2]。当前的治疗方法包括透析，使用替代的氮清除途径以及对重症患者进行肝移植。但是，死亡率仍然很高[3]。

基于腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗可以为当前治疗方案提供替代方案。在过去的几年中，AAV基因治疗已在多种疾病的临床试验中显示出令人鼓舞的结果[4-7]。最近，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个针对遗传性疾病的AAV基因增强疗法[8]。开发的AAV8载体正在一项针对OTCD成年患者的临床试验中进行评估[9]。对于具有早期发作形式的OTCD的患者，早期治疗是可取的。但是，AAV介导的肝定向新生儿基因治疗只能达到短期效果[10-13]。由于AAV载体的非整合性质，大多数载体基因组会在肝细胞增殖过程中丢失。Lili Wang等假设通过基因组编辑将OTC转基因定向整合到宿主基因组中可以解决此问题。靶向基因组编辑是基因治疗的圣杯[14]。在依靠蛋白质DNA结合的锌指核酸酶（ZFN）的引领下，基因组编辑最初以[15]，最近使用AAV载体在体内进行靶向血友病B或粘多糖贮积症I的患者的肝脏[16,17]。CRISPR-Cas9作为一种基因组编辑技术的发现和发展，由于其独特的RNA介导的DNA结合机制，提供了一种相对简单的位点特异性基因组修饰方法[18]。生成特定位点的双链断裂（DSB）后，非同源末端连接（NHEJ）会产生插入和缺失（indels）；当存在供体DNA模板时，同源指导修复（HDR）将供体模板上的DNA序列整合到内源基因座中。鉴于其在许多组织中的高转导效率，AAV载体已被用作为体内基因组编辑应用提供核酸酶和/或供体模板的有效载体[19-24]。Lili Wang等最近开发了一种针对体内的双重AAV矢量方法交付CRISPR-Cas9系统的三个关键组件：Cas9金黄色葡萄球菌的酶（SaCas9），单向导RNA（sgRNA）到鼠OTC基因中的序列，以及供体板来驱动HDR[25]。我们展示了基于HDR的校正肝中10％的OTC等位基因发生G到A突变spf灰鼠，提供了慢性高氨血症的模型，体内基因组编辑带来的临床效益然而，该载体是针对特定突变而开发的，不会适用于非处方药其他地方发生突变的患者基因。像大多数单基因疾病一样，OTCD是由gt; 300 dif-突变遍布整个基因，而不是单个基因显性突变[27]。而且，我们之前的突变抑制方法不仅对成年spf灰鼠无效，而且对会导致成年的spf灰鼠成年致死，原因是它们失去了由大缺失延伸至外显子导致的残留OTC表达小鼠OTC（mOTC）基因中的4个[25]。

在这项研究中，我们旨在开发与突变无关的CRISPR-Cas9介导的基因靶向方法，其中vec-tor系统可用于大多数患有特定疾病（在这种情况下为OTCD）的患者。我们报告单次注射新生小鼠中的AAV8载体系统从未整合的转基因中获得了瞬时的高水平表达，可用于治疗急性新生儿危机。基因组编辑指导的转基因整合可在肝脏中有效，持续和临床有益的基因靶向，而对OTC阳性细胞没有任何选择性的生长优势。

2 结果

2.1开发用于CRISPR-Cas9介导的基因靶向的双重AAV载体系统

为了开发广泛适用于OTCD的基因组编辑载体，Lili Wang等人构建了一个新的AAV8供体载体，其中包含（i）由U6启动子驱动的sgRNA，以靶向mOTC基因座的内含子4[25]和（ii）表达完整功能的小基因密码子优化的人OTC（hOTCco）由肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白（TBG）启动子（TBG.hOTCco.pA）驱动，两侧各有0.9-kb同源臂（称为AAV8靶向供体）；图1 ）。未靶向的对照供体载体包含除20个核苷酸的靶序列以外的所有成分（称为AAV8未靶向的供体）。在CRISPR-Cas9介导的HDR之后，应将转基因盒（称为hOTCco小基因）插入mOTC基因座的内含子4（图1）。我们选择内含子4作为整合位点，因为它被用来校正spf灰小鼠的突变，可以直接比较两种方法与目标DSB的效率和位置无关[25]。

2.2 OTC spf中OTC基因座的体内基因靶向通过AAV小鼠肝脏。

为了确定体内基因靶向效率，Lili Wang等共同注射了AAV8。SaCas9 [每只小狗5times;1010个基因组拷贝（GC）]和AAV8。靶向供体或AAV8。非靶向供体（每只幼犬5times;1011GC）载体通过颞静脉进入产后第2天（p2）spf灰幼崽。我们在注射载体后3和8周收集了肝样品，用于OTC的免疫组织化学和OTC酶活性的组织化学染色（图2，A至C）。用靶向载体治疗的小鼠（称为靶向小鼠）在第3周和第8周分别显示25％和35％的OTC表达肝细胞。在同一时间点，这比用非靶向载体治疗的小鼠（称为非靶向小鼠）高四到三倍（图2D）。处理过的动物在肝脏中散布着表达OTC的细胞簇，包括中央静脉周围通常不表达尿素循环酶的区域（图2C）。靶向小鼠OTC酶活性的组织化学染色在第3周和第8周时，在26％的肝细胞中均显示了功能性OTC的表达，是未靶向小鼠的三倍（图2E）。在这两个时间点上，大多数OTC阳性肝细胞都位于散布在目标小鼠肝脏所有部分的簇中，这与整合以及随后在肝脏生长的情况下克隆扩增相一致。从第3周和第8周从目标小鼠获得的肝匀浆中的OTC酶活性的直接测量结果分别显示了野生型（WT）水平的70％和79％，在同一时间点分别比未靶向小鼠高出两倍和三倍（图2F）。通过OTC酶活性的组织化学染色，在肝匀浆中测得的OTC活性水平比OTC阳性肝细胞的百分比高约三倍（图2E），这表明编辑过的肝细胞表达的OTC水平高于内源基因。这可能是由于hOTCco的密码子优化互补DNA和使用强肝特异性TBG小基因中的启动子。免疫组织化学证实，来自hOTCco小基因的单个肝细胞中OTC的表达水平高于野生型小鼠的肝细胞中的OTC表达水平（图2，A和B）。

Lili Wang等人还通过定量聚合酶链反应（PCR）测量了肝脏中的hOTCco拷贝。载体处理后3周，我们在未靶向和靶向小鼠中每个二倍体基因组检测到7至8个hOTCco拷贝（图2G）。载体处理后第8周，hOTCco拷贝在非靶向小鼠中每个二倍体基因组减少至2个拷贝，在靶向小鼠中减少为5个拷贝，但靶向组和非靶向组之间的差异无统计学意义（图2G）。一些hOTCco供体载体DNA（未靶向或靶向）可能以游离型连接体的形式存在于细胞中，或已随机整合到宿主基因组中。

高蛋白饮食挑战评估的临床益处为了进一步评估基因靶向对OTCD临床表现的影响，Lili Wang等评估了7周过程中spf灰小鼠对高蛋白饮食7天疗程的耐受性产后媒介管理。我们纳入野生型同窝仔，未治疗的spf灰小鼠和未靶向的spf灰小鼠作为对照。在高蛋白饮食过程的最后，我们发现血浆氨从野生型对照组的37plusmn;5M（n = 10）增加到spf灰的314plusmn;55M（n = 15）。对照（P lt;0.001）（图3A），与Lili Wang等之前的发现一致。Lili Wang等观察到未治疗的spf灰小鼠血浆氨水平存在显着变化，这与OTCD患者在相对较短的时间内显示出相当大的氨波动相一致（26）。本课组没有观察到未经治疗的spf灰小鼠和未靶向的小鼠之间的显着差异

图1 AAV对OTC spf灰小鼠肝脏中OTC基因座的体内基因靶向.萨卡斯9.小鼠OTC基因座示意图，显示位于内含子4中的SaCas9靶位点，AAV供体载体和同源重组后的修饰的小鼠OTC基因座，AAV供体

载体包含由同源臂组成的U6-sgRNA1和TBG-hOTCco-pA盒ITR，反向终端重复。

Fig. 1. In vivo gene targeting of the OTC locus in the OTC spf ash mouse liver by AAV.SaCas9. Schematic diagrams of the mouse OTC locus showing the SaCas9 target site located in intron 4, the AAV donor vector that contains U6-sgRNA1 and TBG-hOTCco-pA cassettes flanked by homology arms, and the modified mouse OTC locus after homologous recombination .ITR, inverted terminal repeat.

图2作为AAV8新生儿的spf小鼠肝脏中OTC的高效持续表达。SaCas9介导的基因靶向。AAV8将SaCas9（每只幼崽5times;1010GC）和AAV8.sgRNA1.hOTCco供体（每只幼崽5times;1011GC）通过颞静脉施用于p2 spf幼崽。在治疗后第3周（目标为3周； n = 6）或第8周（目标为8周； n = 8）对spf小鼠实施安乐死。未定向的spf小鼠收到AAV8。SaCas9（每只小狗5times;1010GC）和AAV8.control。hOTCco供体（每只幼犬5times;1011GC）在p2时，在治疗后第3周（未靶向，3周； n = 5）或8周（未靶向，8周； n = 8）收获肝脏。包括未经处理的野生型（n = 8）和spf小鼠（n = 8）作为对照。（A）用双AAV载体处理的spf小鼠肝脏切片上的抗OTC抗体进行免疫荧光染色，以进行CRISPR-SaCas9介导的基

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