成年斑马鱼脑中的放射状胶质细胞特异性消融外文翻译资料

 2022-08-07 15:00:53

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成年斑马鱼脑中的放射状胶质细胞特异性消融

清水勇树 伊藤洋子 田中英美 大岛敏夫

日本东京早稻田大学生命科学与医学生物科学系，分子脑科学实验室

摘要：斑马鱼的大脑在整个生命中可以持续的在广泛的神经源性脑区形成新的神经元。相比之下，成年哺乳动物脑内的神经形成仅限于室下区（SVZ）和齿状回（DG）。在成年哺乳动物大脑的神经源性区域，放射状神经胶质细胞（RGCs）被认为具有神经干细胞（NSCs）的功能。我们构建了一个Tg（gfap：Gal4FF）转基因斑马鱼品系，这使我们能够在RGCs中表达特定基因。为了研究RGCs在成年斑马鱼脑神经形成中的作用，我们还构建了一个Tg（gfap:Gal4FF；UAS:nfsB-mcherry）转基因斑马鱼系，该转基因斑马鱼系允许用甲硝唑（Mtz）诱导RGCs细胞死亡。Mtz处理可特异性消除表达硝基还原酶的RGCs，从而减少了增殖性RGCs的数量。使用Tg（gfap：Gal4FF;UAS：nfsB-mcherry）转基因斑马鱼品系，我们发现RGCs在成年斑马鱼端脑中被特异性消融。Tg（gfap：Gal4FF）斑马鱼品系可能有助于研究RGCs的功能。

关键词：斑马鱼成体神经发生； 细胞消融； 转基因； Gal4-UAS

介绍：在哺乳动物的大脑中，成体神经发生仅限于脑室下区域（SVZ）和齿状回（DG）（Cameron和McKay，2001；Doetsch等，1997；Gage等，1998）。但是，在成年硬骨鱼脑（例如斑马鱼的脑）中，在几个区域观察到了增殖细胞（Adolf等，2006；Grandel等，2006）。先前的研究表明，成年斑马鱼端脑内的放射状胶质细胞（RGCs）可以被BrdU标记，并表达增殖细胞核抗原（PCNA）和一些干细胞标记物，如Sox2（Lamet al.，2009；M Eurzet al.，2010；Vialesset al.，2014）。然而，调节成体神经发生的细胞和分子机制仍然未知。成年斑马鱼末梢脑中的RGCs具有神经干细胞（NSCs）的功能，但在视顶盖和小脑处于休眠状态，其中神经上皮样NSCs保持自我更新和多功能性（Ito等，2010；Kaslin等，2009；Rothenaigner等，2011）。为了研究体内神经干/母细胞中调节基因的功能，Gal4-UAS系统已用于包括斑马鱼在内的动物模型中。酵母转录激活因子Gal4FF可以仅在Gal4FF阳性细胞中在上游激活序列（UAS）的控制下激活任何基因的表达（Asakawa等，2008）。在这里，我们报告了在gfap调控序列下表达Gal4FF的Tg（gfap：Gal4FF）转基因斑马鱼品系的生成，并证实了Gal4FF仅在RGCs中表达。

细胞特异性消融是研究特定细胞类型作用的强有力工具。硝基还原酶（NTR）介导的细胞消融使我们能够在特定时间点以细胞类型特异性的方式诱导细胞死亡（Bridgewater等，1997；Petrie等，2014；Pisharath等，2007）。甲硝唑（Mtz）是NTR的底物，结合还原NTR并转化为细胞毒性DNA交联代谢物，可特异性诱导NTR阳性细胞凋亡。NTR介导的细胞消融最常见的底物是CB1954。然而，CB1954代谢物由于其细胞渗透性而具有旁观者效应（Bridgewater等，1997；Felmer和Clark，2004）。使用NTR/Mtz系统没有观察到旁观者的影响。因此，为了特异地靶向和消除RGCs，我们通过将Tg（gfap：Gal4FF）品系与Tg（UAS：nfsB-mcherry）品系杂交，生成了Tg（gfap：Gal4FF;UAS：nfsB-mcherry）转基因斑马鱼品系大肠杆菌衍生的NTR，nfsb（Rau和Stolz，2003）在Gal4FF阳性细胞中特异性表达。通过向培养基中添加Mtz，该转基因品系能够专门在RGCs中诱导细胞消融。因此，Tg（gfap：Gal4FF）品系和Tg（gfap：Gal4FF；UAS：nfsB-mcherry）品系是研究RGCs功能的强大工具。

材料和方法

动物

斑马鱼（Danio rerio）按照标准程序进行护理（Westerfield，2007）。所有实验均根据早稻田大学动物护理机构和使用委员会批准的方案进行。RIKEN Wako（RW）野生型斑马鱼从日本斑马鱼国家生物资源中心获得。(http://www. shigen.nig.ac.jp/zebra/)。Tg2（UAS：GFP）nnsp19和Tg（UAS：nfsB-mcherry）rw0144品系由Higashijima博士（Asakawa等，2008）和冈本博士（Agetsuma等，2010）分别提供。在这项研究中，我们使用3至5个月龄斑马鱼被视为成年鱼的斑马鱼。

转基因斑马鱼品系的产生

使用gfap：GFP质粒作为模板，通过PCR扩增7.4-kb gfap调控元件。gfap：GFP质粒（Bernardos和Raymond，2006）由Raymond博士提供。gfap调控元件5`-GAATGGGCCCGTAAGGACTGAGGTGATG-3`和5`-GTAACCTGCAGGGAGGA ACGCTGGGACTCCA-3`的特异性引物将通过ApaI和SbfI位点分别添加到PCR产物中。通过ApaI和SbfI消化扩增的PCR产物使用QIA-快速凝胶提取试剂盒（Qiagen）纯化。接下来，将gfap调节元件连接至T2KhspGFF质粒的ApaI和SbfI位点（Asakawa等，2008）。向单细胞阶段的斑马鱼胚胎中注射了T2KgfapGal4FF构建体（3ng/Il）和Tol2转座酶mRNA。Tg(gfap:Gal4FF)将其与Tg2（UAS：GFP）nnsp19杂交，生成Tg（gfap：Gal4FF;UAS：GFP），其在Gal4FF阳性细胞中特异性表达GFP。我们获得了三个Tg（gfap：Gal4FF）品系：Tg（gfap：Gal4FF）wa32，Tg（gfap：Gal4FF）wa53和Tg（gfap：Gal4FF）wa73；在该研究中使用了Tg（gfap：Gal4FF）wa32系。我们还通过将Tg（gfap：Gal4FF）wa32与Tg（UAS：nfsB-mcherry）rw0144杂交来生成Tg（gfap：Gal4FF;UAS：nfsB-mcherry）品系。本文所述的转基因鱼系可应要求提供给研究机构。

组织学

对于免疫组织化学，将斑马鱼在0.017％的三卡因中麻醉，并在心内灌注林格氏液，然后再灌注4％的多聚甲醛（PFA；Wako）溶液。从颅骨中取出大脑，并在4％PFA溶液中于48°C后固定过夜。然后将整个大脑包埋在20％蔗糖和O.C.T化合物（Tissue-Tek）的2：1混合物中在48°C过夜。然后使用低温恒温器（MicromHM500M；Leica）切割切片（14-mu;m厚）。如先前所述（Ito等人，2010），在14-mu;m厚的冷冻切片上进行了免疫组织化学。使用的主要抗体是小鼠抗PCNA（1：200；Dako），兔抗神经胶质原纤维酸蛋白（GFAP）（1：500；Dako）和兔抗脑结合脂质蛋白（BLBP）（1：500；Millipore）抗体。使用的二级抗体是Alexa Fluor488-、594-、和647-偶联的亚类特异性抗体（1：500；Invitrogen）。将节嵌入PermaFluor（Thermo）中。为了对PCNA进行免疫检测，在将玻片在10mM柠檬酸钠中于858°C孵育30分钟后进行抗原修复，然后用一抗进行处理。为了进行核染色，在进行免疫组织化学后，将样品在Hoechst 33258（1：500；Wako）中孵育30分钟。

Mtz的处理

通过将其溶解在鱼水中来用Mtz（Sigma目录号M1547）。对于Mtz处理，将斑马鱼连续5天用5mM浓度的Mtz溶液处理1小时。在Mtz处理期间，斑马鱼被置于黑暗中以避免Mtz的光解。

细胞定量/细胞计数

为了定量在成年斑马鱼端脑中的BLBP阳性细胞群中GFP或mcherry阳性细胞的百分比以及PCNA/GFAP双阳性细胞的数量，准备了上面提到的14-mu;m厚的端脑连续冠状冰冻切片。GFP或mcherry阳性在带有UPlanApo 20times;（NA 0.70）的FV1000显微镜（Olympus）和带有UPlanApo的BX50显微镜（Olympus）下，对端脑的每隔第二部分（鼻端至尾端；最少10个部分）的PCNA/GFAP双阳性细胞进行计数20times;（NA 0.70）。每个实验三个大脑用于细胞定量。GFP-或表达的Mcherry阳性细胞和PCNA/GFAP双阳性细胞的数量是指plusmn;SEM。

显微镜和数据分析

对于荧光显微镜，使用了具有UPlanApo 20times;（NA 0.70）和UPla-nApo 40times;（NA 0.75）物镜的BX50显微镜（Olympus）。对于激光扫描共聚焦显微镜，使用配有BX61显微镜（Olympus）的FV1000显微镜（Olympus），该显微镜配有UPlanSApo 20times;（NA 0.75）和UPlanSApo 40times;（NA 0.90）物镜。使用AdobePhotoshop和Adobe Illustrator（Adobe）处理图像。

统计分析

所有数据均表示为平均值plusmn;SEM。AP值lt;0.05被认为具有统计学意义。使用Mann-Whitney和Excel软件（Microsoft）对mcherry阳性细胞计数进行统计分析。PCNA/GFAP双阳性细胞分析使用单因素方差分析（ANOVA）进行计数，Tukey-post-hoc分析采用Graph-Pad-PRISM软件版本6.0b。

结果

幼年斑马鱼脑中RGCs特异性Gal4FF表达。

为了产生Gal4FF在RGCs中特异性表达的转基因斑马鱼，将gfap调控元件与Tol2转座子系统一起使用（请参见材料和方法）。将F1胚胎培养至成年，并与Tg（UAS：GFP）品系杂交，以鉴定Tg（gfap：Gal4FF）亲代。为了确认Gal4FF是否在RGCs中特异性表达，我们通过用抗GFAP抗体进行免疫分析，分析了受精后1个月（1mpf）Tg（gfap：Gal4FF;UAS：GFP）幼鱼中GFP的表达模式。在端脑中，我们检测到GFP在心室区（VZ）和后脑膜的GFAP阳性细胞中表达（支持信息图1）。这些结果表明，Gal4FF在幼年Tg（gfap：Gal4FF；UAS：GFP）斑马鱼脑中的RGCs中特异性表达。成年斑马鱼脑中RGCs特异性Gal4FF表达。为了确认Tg（gfap：Gal4FF）斑马鱼可用于研究RGCs在成体神经发生中的功能，我们分析了GFP在成年Tg（gfap：Gal4FF；UAS：GFP）斑马鱼脑中的表达模式。在末梢脑中，我们在VZ和后脑皮层的GFAP阳性细胞中检测到GFP（图1a–d）。在视神经皮质中，在脑室周围灰色区深层（PGZ；Sup-移植信息图2a–c）。在小脑中，RGCs充当了祖细胞迁移的支架（Kaslin等，2009），在位于上菱形唇的GFAP阳性细胞中检测到了GFP（支持信息图2d–f）。在视网膜中，GFAP是在毛勒胶质细胞中表达，在GFAP中检测到GFP阳性细胞（支持信息图2g–i）。在脊髓的GFAP阳性细胞中也检测到了GFP（支持信息图2j–l），其中已知RGCs充当神经干细胞并通过胶质桥形成修复受损的脊髓组织（Goldshmit等，2012）。为了证实GFP是否在RGCs中特异性表达，我们通过用抗BLBP抗体进行免疫染色来量化了端脑中GFP/BLBP双阳性细胞的百分比（图1e–h）。为了计算GFP阳性细胞的数量，我们使用BLBP作为RGCs标记，因为抗GFAP抗体标记RGCs进程但不标记活体脑细胞，而抗BLBP抗体标记RGCs进程和活体脑细胞。在端脑（Dm）域中，端脑中GFP/BLBP双阳性（GFP（1）/BLBP（1））细胞的百分比为97.51plusmn;2.49％，在背外侧（Dl）域中为98.11plusmn;1.89％，在腹侧端脑（Vd）域的背核中为98.85plusmn;1.15％，以及在腹侧脑室（Vv）域的腹核中占94.31plusmn;5.69％（图1i）。这些结果表明，Gal4FF在成年Tg（gfap：Gal4FF；UAS：GFP）斑马鱼脑中的RGCs中特异性表达。

成年斑马鱼脑中RGCs特异性NTR表达。

在成年斑马鱼端脑中，BrdU脉冲追踪显示，RGCs充当成体神经发生的神经干/祖细胞（Lam等，2009）。为了研究RGCs在成体神经发生中的功能，我们构建了Tg（gfap：Gal4FF;UAS：nfsB-mcherry）品系，其中我们可以通过Mtz治疗特异性地消融RGCs。当将Tg（gfap：Gal4FF）品系鱼与Tg（UAS：nfsB-mcherry）品系鱼杂交时，我们观察到受精后24h（数据未显示）和mcherry在Tg（gfap：Gal4FF；UAS：nfsB-mcherry）品系胚胎中mcherry的表达（数据未显示）。阳性胚胎长到成年。我们通过用抗GFAP抗体进行免疫染色分析了成年大脑中细胞的表达模式（图2a–d）。在用于细胞消融的Tg（gfap：Gal4FF;UAS：nfsB-mcherry）行中，mcherry与GFAP在Dm和Vd域中共同表达，但在Dl或Vv域中弱表达。我们计算了每个域中的mcherry/BLBP双阳性细胞（mcherry（1）/BLBP（1））的数量。在Dm域中，mcherry（1）/BLBP（1）细胞的百分比为91.27plusmn;2.02％，在D1域中为9.61plusmn;1.47％，在Vd域中为43.61plusmn;4.51％，以及Vv域中为8.71plusmn;5.98％（图2i）。这些结果提示nf

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