Prm1p，一种受信息素调控的跨膜蛋白，在酵母菌交配过程中促进血浆 膜融合外文翻译资料

 2022-08-08 09:46:01

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Prm1p，一种受信息素调控的跨膜蛋白，在酵母菌交配过程中促进血浆 膜融合

摘要 细胞融合发生在从受精到器官发生的整个发育过程中。在这些过程中驱动质膜融合的分子机制仍然未知。尽管酵母交配提供了一个出色的模型系统来研究细胞融合，但先前显示的所有调控该过程的基因都在细胞壁破裂时或之前起作用。即，在两个质膜已经接触之前。使用一种新的策略，其中使用基因组数据来预测哪些基因可能具有给定的功能，我们鉴定了PRM1，这是一种在交配过程中选择性表达的基因，它编码跨膜蛋白。Prm1p定位于发生融合的细胞间接触部位。在！ iprm1 mu-之间的交配

固定，大部分细胞启动合子形成并降解分离交配伴侣的细胞壁，但随后无法融合。电子显微镜分析显示，这些配对对中的两个质膜紧密并置，仅以“-” 8 nm的均匀间隙保持分开。因此，！iprm1 突变体的表型定义了在该膜的配对反应中的新步骤可能通过定义的粘附连接点并列，但仍未融合， 该表型表明Prm1p在质膜融合中的作用。

介绍

膜融合的核心问题是如何使两层双层的疏水性脂质核心跨过一团水。病毒与宿主细胞融合以及运输囊泡与质膜和细胞器融合的研究已经找到了答案。在这些系统中，融合蛋白或融合酶驱动反应。对于流感病毒， 融合酶是血凝素蛋白；对于囊泡，融合酶包括SNARE1

（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体） 复合物（有关最新综述，请参见Hernandez等，1996； Jahn和Sudhof，1999）。尽管血凝素和SNARE的组成 不同-血凝素是一种能够直接插入宿主细胞质膜的病 毒表面蛋白，而SNARE复合物是由与不同双层相关的 亚基组装而成的-它们的最终结构具有显着的相似性

（Weber等， 1998）。在每种情况下，组装的融合酶都有插入两个相对的双层中的每一个中，并在这些域之间插入一个非常稳定的盘绕线圈（ Hughson， 1995； Harbury，1998）。根据目前的模型，形成这种盘绕 线圈的能量学非常有利，以至于它们将带负电的磷酸 根基团聚集在一起并挤出其中的水的成本超过了成本， 从而引发了双层熔融（Ramalho-Santos和de Lima ， 1998； Weber等，1998）。

尽管这种相对详细的机制模型很好地说明了病毒在 分泌途径中的融合，但仍无法解释膜融合的重要类别， 即细胞融合。受精过程中，精子和卵之间发生细胞融 合，成肌细胞中的合胞组织发育期间成肌细胞前体细 胞融合成长管并分化为肌纤维，巨噬细胞吞噬吞噬细 胞或碎屑等过程免疫细胞质膜的分离区域必须融合才能完全吞噬（ Hernandez 等， 1996 ； Shemer 和Podbilewicz，2000）。在每种情况下，一对质膜双 层都从细胞外融合。因此，这些细胞是否表达了一种 更像病毒融合酶的拓扑结构的特殊SNARE？

如果是这样，则尚未找到。迄今为止鉴定出的最接近的蛋白质是ADAMs，其整体膜蛋白

tein包含与血凝素部分相似的肽，该部分插入宿主细 胞的质膜中（Blobel等，1992； Bigler等，1997）。受精过程中，精子上的ADAM在另一种蛋膜蛋白CD9的帮助下与蛋上的a113融合蛋白结合（ Almeida等， 1995； Chen等，1999）。阻断这种相互作用或去除CD9会抑制精卵融合（Chen等，1999； Le Naour等， 2000； Miyado等，2000）。由于已知该复合物中的蛋白质均不包含卷曲螺旋，因此这种结构如何产生使 膜足够接近融合所需的力仍然是一个谜。

为了鉴定介导细胞融合的新型蛋白质，我们转向了酵母交配的模型系统，其中两个单倍体细胞融合以产生二倍体。配对反应如下进行。单倍体以两种交配类型中的一种存在，即a或a，它们分泌信息素（分别是 相反交配类型的细胞可以检测到的信息素）。当信息素浓度达到一定水平时，开始进行交配反应。交配的第一步包括细胞周期停滞，细胞壁重塑以及交配伴侣彼此极化。当配对对象接触时，细胞壁会编织在一起以形成连续的外层。在这一点上，配对伴侣牢固地附着在一起，但每个伴侣仍被细胞壁完全包围，质膜尚未接触，细胞当然尚未融合。据说此阶段的细胞已形成“配对”或“前合子”。为了完成合子的形成，分隔伴侣的细胞壁必须降解，质膜必须接触并融合，最后单倍体核必须合并为单个二倍体核。

通过寻找可以形成交配对而不是二倍体的细胞，许 多遗传筛选已经鉴定出在这些步骤中有缺陷的突变体。然而，所有突变体都在细胞壁破裂或核融合的步骤中 停留在交配反应中（综述于Berlin等，1991； Marsh 和Rose，1997）。尽管这些类型的基因已经提供了对 细胞极化，细胞壁重组，渗透稳定性控制以及细胞器 定位和动力学的深入了解，但是介导在质膜正确并置 之后进行实际脂质双层融合步骤的基因仍然难以捉摸。我们已经利用最近积累的大量基因表达数据来寻找可 能控制质膜融合的蛋白质。

材料和方法

信息学

程序是用脚本语言Perl编写的。Webminer的源代码和所用数据库格式的描述可在以下位置获得http://webminer.ucsf.edu. 通过在斯坦福大学DNA测序中心（Stanford University DNA Sequencing Center） 的BLAST搜索未完成的基因组测序项目来鉴定PRM1的白色念珠菌和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）同源物http://www- sequence.stanford.edu/group/candida, 和 位 于 的 桑 格 中 心http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe, 分 别 。 用 MultAlin

（ Corpet ， 1988;http://protein.toulouse.inra.fr/multalin.html). 使用SOSUI 程 序 进 行 跨 膜 结 构 域 预 测 （ Hirokawa 等， 1998 ； http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0E.html), 然后通过抛弃所有同系物中不存在的假定跨膜片段进行精制。如Singh等人所述， 使 用 LearnCoil-VMF 进 行 卷 取 线 圈 预 测 。

（1999;http://nightingale.lcs.mit.edu/cgi-bin/vmf).

酵母菌株和质粒

本研究中使用的菌株列于表I。通过PCR转化技术（Longtine等， 1998）生成了基因置换，表位标记的构建体和绿色荧光蛋白（GFP） 融合体：使用独特的引物进行PCR一组标准质粒质粒以产生线性DNA， 线性DNA由一对靶向PRM1的整合序列组成，侧接通用盒。该盒包含 三个拷贝的血凝素（HA）-表位标签，GFP的编码序列或两者都不包 含，以及一个选择标记。野生型二倍体的转化导致该构建体的插入， 从而使其取代了整个PRM1编码序列，或者为了进行基因标记，在其 3末端插入了框架，从而取代了天然终止密码子。选择后，通过PCR分析二倍体以正确插入构建体，然后形成孢子以回收携带整合 的DNA的两种交配类型的单倍体。如前所述，质粒pDN291用于表达 可溶性胞质GFP（Ng和Walter，1996）。质粒pRS314和pRS316是分 别包含TRP1和URA3基因的标准载体，在这里用于创建一组交配类型 特异性选择标记（Sikorski和Hieter，1989）。

细胞裂解液的制备和蛋白质印迹

为了检测Prm1p-HA 的表达，用10 micro;l含5 mg / ml因子（ Sigma- Aldrich）的DMSO溶液处理5 ml光学密度为0.5 UA600 的指数生长培养物，或与相等数量的相反交配类型的细胞，也来自指数生长的培养物。当混合两种交配类型的细胞时，当两种培养物在对数相中从极低密度连续生长过夜时，可以看到最大的基因诱导，这可能是因为信息素可以在培养基中积累。实际上，仅这些培养物的条件培养基具有可检测的诱导活性（未显示）。在混合后的相关时间点，将培养物在4℃下短暂旋转，并吸出上清液。细胞沉淀重悬于50

micro;l SDS-PAGE样品缓冲液，加入到少量玻璃珠中，并在4°C连续涡旋90 s裂解。整个过程花了

lt;4分钟将裂解物煮沸10分钟，然后旋转以除去不溶性碎片。或者， 对于糖苷内切酶H处理，将细胞

表I.本研究中使用的菌株

应变 基因型

MHY200 MATa, PRM1-HA:S.kluyveri HIS3 , ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pRS314

MHY201 MATa, PRM1-HA:S.kluyveri HIS3 , ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pRS316

第153章 MATa, PRM1-GFP:S.kluyveri HIS3 , ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pRS314

第154节 MATa, PRM1-GFP:S.kluyveri HIS3 , ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pRS316

MHY209 MATa, his3-!i200, ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pRS314

MHY210 MATa, his3-!i200, ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pRS316

MHY198 MATa，！iprm1 ::: S.kluyveri HIS3 ，ura3-！i99，leu2-！i1，trp1-！i99，ade2- 101赭石，pRS314

MHY199 MATa, !iprm1::S.kluyveri HIS3 , ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pRS316

MHY189 MATa, his3-!i200, ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pDN291

MHY191 MATa, !iprm1::S.kluyveri HIS3 , ura3-!i99, leu2-!i1, trp1-!i99, ade2-101赭石, pDN291

所有菌株均在W303背景下构建。

如制造商（New England Biolabs，Inc.）所提供的那样，用45 micro;l变 性缓冲液代替样品缓冲液，按上述方法裂解。然后将样品煮沸10分钟， 与所提供的5 micro;l G5缓冲液和1 micro;l酶混合，在37°C下孵育90分钟，并在 上样之前在SDS-PAGE样品缓冲液中以1:10稀释。对于蛋白质印迹分析， 将裂解物在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用标准方案转移 至硝酸纤维素膜上。用1：1,000稀释度的小鼠单克隆抗HA一抗（HA.11; Covance）和1：2,000稀释度与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠二抗

（Bio-Rad Laboratories）印迹膜。带有增强的化学发光试剂盒（文艺复兴时期试剂盒； NEN Life Science Products）。

Prm1p-GFP的荧光显微镜

为了可视化Prm1p-GFP在信息素处理的单倍体中的定位，使细胞在含有两倍标准浓度腺嘌呤的确定培养基中生长至对数期，以防止腺嘌呤生物合成的自发荧光副产物积累。然后将文化暴露于10

微克/毫升是一个因素。加入信息素后第40、70和100分钟取样，放置在载玻片上，并在共聚焦显微镜（Leica）上成像。或者，要检查Prm1p-GFP在受精卵中的定位，将分别携带PRM1-GFP融合体的相反交配类型的细胞生长至对数期，等量混合，点在酵母提取物/蛋白p /葡萄糖（YPD）板上，在30°C下孵育2小时。然后将细胞从板上重悬，点在载玻片上并成像。由于Prm1p-GFP信号微弱，因此首先对四个高强度激光扫描取平均值，以获取单个内侧光学切片，从而使大部分荧光白化。然后，收集八个光学部分的堆栈

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