从Vigna angularis L.小豆中纯化5-磷酸二酯酶外文翻译资料

 2022-08-08 10:53:12

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从Vigna angularis L.小豆中纯化5-磷酸二酯酶

摘 要

小豆的5-磷酸二酯酶（5-PDE）含量高，这是一种可以形成增味5-核苷酸的酶。在这项工作中，来自小豆的5-PDE被纯化。丙酮沉淀（1个粗提取物：1.25冷丙酮）被用作第一步纯化步骤，因为在进入快速蛋白质液相色谱系统（FPLC）的应用之前，通常将其用于酶纯化以减少不需要的蛋白质。依次进行了三种主要的纯化技术：脱盐（使用Hi Prep 26/10脱盐柱），阴离子交换色谱法（使用Hi-Trap DEAE Fast Flow柱）和凝胶过滤色谱法（使用Superose 12 10/300 GL色谱柱）。所采用的纯化方案产生了13.37％的5-PDE，其纯化倍数为6.7，比活性为35.2 micro;mol对硝基苯酚/ min / mg蛋白。小豆5-PDE的分子量通过凝胶过滤色谱法进行了评估，方法是将包含最高5-PDE活性的级分与标准蛋白质的分子量（1.35–669 kDa）进行比较。进行天然PAGE以确定凝胶过滤级分中显示一条带的蛋白质的均质性。 SDS-PAGE分析表明该酶由两条相同的多肽链（亚基）组成，每条多肽链的分子量为62 kDa。因此，使用SDS-PAGE估计的天然蛋白质的分子量为124kDa。

关键词：5′-磷酸二酯酶 纯化 阴离子交换色谱 凝胶过滤色谱 分子量

  1. 介 绍

5-磷酸二酯酶（5-PDE，E.C 3.1.4.1）从3-羟基末端的寡核苷酸的3-羟基末端切割5-核苷酸，该3-羟基末端的寡核苷酸来自RNA [1]。 5-单核苷在生化上很重要，可用于医药，保健，农业和化妆品[2]。与核苷2-单磷酸酯或核苷3-单磷酸酯相比，它可以用作调味料。 5-单核苷，特别是5-氨基磺酸单磷酸二钠（5-IMP）和5-鸟嘌呤单磷酸二钠（5-GMP）具有鲜美的鲜味，因为有谷氨酸钠（MSG）和5单核苷磷酸盐的协同作用[3, 4]。5-核苷酸的制备方法如下：微生物发酵，化学合成或酶促制备[1, 5]。 5-磷酸二酯酶有各种各样的来源。其中包括大麦根茎等植物，蛇和大鼠等动物[6–10]。它被发现在诸如热纤梭菌，拟南芥，枯草芽孢杆菌和米鱼腥藻等微生物中[11–14]。在我们以前的工作中，确定发芽15小时后，小豆产生的5-磷酸二酯酶的量最高[15]。然而，提取的5-磷酸二酯酶为粗制形式，需要进一步的纯化过程。

在这项研究中，纯化的定义是从一种复杂的物质混合物（包括其他蛋白质）中分离出一种酶，同时保持目标酶的生物学功能。5-PDE纯化的常用技术包括硫酸铵沉淀，Sephadex G-100凝胶过滤色谱和DEAE-Sepharose离子交换色谱[16] 等得到5-PDE。在热灭活，超滤，硫酸铵沉淀，苯基琼脂糖凝胶色谱，DEAE纤维素色谱和Sephadex G-75色谱纯化后5-PDE的产率为5.42，纯化倍数为93.42。Harvey等人[18]使用不同的方法，例如在pH 4沉淀，硫酸铵沉淀，丙酮沉淀，CM-纤维素离子交换色谱法，随后冻干（冷冻干燥），Sephadex G-200凝胶过滤色谱法和DEAE-纤维素离子交换色谱法进行纯化5-PDE，最终产率为8.5％，从胡萝卜中提纯了300倍。罗等人[19]应用了超滤，硫酸铵沉淀，二乙氨基甲基（DEAE）-纤维素离子交换色谱和DEAE-琼脂糖CL-6B离子交换色谱从烟曲霉中纯化5-PDE。

Beluhan等人[20]结合了热处理和丙酮沉淀法从大麦中部分纯化5-PDE的最终收率为31％，纯化倍数为38，比酶活性为30单位酶/ mg蛋白质，其中酶的定义为释放的量，单位1 mol对硝基苯酚/分钟。Futai和Mizuno[21]使用硫酸铵沉淀，DEAE-纤维素离子交换色谱法和Sephadex A-50凝胶过滤色谱法成功地从大鼠肝脏中得到纯化了200倍的5-PDE。酶的纯度通常通过天然的聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）来确定。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）被称为变性PAGE，因为SDS本质上将所有蛋白质转变为没有二级结构和其他更高结构的线性形式。加入还原剂如DTT或beta;-巯基乙醇会还原半胱氨酸的二硫键。 SDS-PAGE可以解离通过非共价键（例如离子键或氢键）连接的蛋白质的亚基；因此，尽管在某些情况下带正电荷的蛋白质不会向下迁移到正电极，并且必须为SDS添加它们，但是在这种情况下，优选天然凝胶[22]。

在这项研究中，丙酮沉淀，脱盐，离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法用于从已发芽15 h的（Vigna angularis L.）小豆中部分纯化5-PDE。凝胶过滤后酶提取物的均质性使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）确定，而分子量则使用凝胶过滤色谱法和SDS-PAGE估计。

第二章 材 料 和 方 法

1材料

（Vigna angularis L.）小豆，称为红豆，是从马来西亚雪兰莪州Sri Serdang的一个本地干货市场采购的。它是从中国天津进口的。将小豆浸入100 mL的0.3％（v/v）次氯酸钠溶液中5分钟后进行表面灭菌，然后用灭菌蒸馏水洗涤5次，然后在15mL水中发芽15h[15]。5-PDE的底物5-胸苷酸单(4-硝基苯基)酯单钠盐（硝基苯基-pT）购自德国Steinheim的Sigma-Aldrich Chemie GmbH。酶测定和提取中使用的所有其他化学药品均为分析纯品。

2方法

2.1酶提取

5-PDE是从已发芽15 h的小豆中提取的，因为这种条件下产生的5-PDE活性最高[15]。小豆的萌发是通过将250g小豆在0.3％（v/v）次氯酸钠溶液中表面灭菌5分钟并用蒸馏水冲洗五次来进行的。然后将豆子放入盖有铝箔的250 mL无菌烧杯中（预先用15 mL蒸馏水和棉绒高压灭菌），并在室温黑暗条件下发芽。 15小时后，将豆（250g）在研磨机中与1000mL的pH 4.5的50mM乙酸盐缓冲液一起匀浆。在冰浴中搅拌30分钟后，将匀浆物通过一块平纹细滤布过滤。然后将滤液在10°C下于12,5000times;g离心15分钟（Sartorius 3-18 K型离心机，Sartorius AG，​​Weender Land Strasse，德国哥廷根）[23]。丢弃沉淀，上清液（粗酶提取物）用于5-PDE分析，蛋白质含量测定和后续纯化。重复萃取两次，以获得2000mL的上清液，用于进一步的纯化步骤。

2.25-磷酸二酯酶测定

5PDE分析反应混合物由酶提取物（0.1 mL），pH值为7.0的200 mM磷酸盐缓冲液（0.2 mL）和1 mg / mL硝基苯基-pT（含对硝基苯基一磷酸基团的胸苷）作为基质（0.2 mL）。将混合物在55°C的水浴中放置10分钟，使底物转化为黄色的对硝基苯酚和5-胸苷一磷酸，然后向其中添加0.1 N NaOH溶液（0.5 mL）终止反应，然后在12,5000times;g和10°C下的冷冻台式离心机（Sartorius Model 3–18 k，Sartorius AG，​​Weender Land Strasse，德国哥廷根）离心之前，将其置于分光光度计上，在405 nm下进行测量，将等分的酶在沸水浴中加热（5分钟）作为对照，将一单位酶（U）定义为形成1 micro;mol对硝基苯酚所需的酶量每毫升酶提取物（1分钟，55°C，pH 7.0），而比活性表示为单位活性/ mg蛋白[18]。2.35-磷酸二酯酶的纯化

5-PDE的纯化由一系列分步技术组成，即将粗细胞提取物冷丙酮沉淀，然后进行脱盐，阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱。后三种技术是使用快速蛋白液相色谱（FPLC）（LNV-907，Amersham Bioscience，瑞典）实现的，该设备配备了P-700泵，UV-900检测器，PH / C-900缓冲液混合室，和Frac-900馏分收集器。

2.4丙酮沉淀

粗品5-PDE提取物通过冷丙酮沉淀进行浓缩。将已预先冷却至-20°C的丙酮缓慢添加至1000 mL提取物中，使酶提取物与冷丙酮的比例为1：1.25，然后在4°C下缓慢搅拌1 h。通过在4°C下以12,000 x g离心15分钟（共使用50times;50 mL耐溶剂离心瓶）收集沉淀的蛋白质。保留沉淀，同时弃去上清液。将离心管中的沉淀分别重新悬浮于10 mL的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中，然后合并。丙酮沉淀后获得的酶溶液为600 mL（从60个试管中收集）。然后将酶溶液保持在4°C，然后继续下一个纯化步骤。在这项研究中，研究了不同的粗酶提取物和冷丙酮比例（1：0.5、1：0.75、1：1.0和1：1.25）对5-PDE纯化的影响。

2.5酶提取液脱盐

用丙酮盐析后获得的酶溶液（600mL）进行脱盐。手动进样到色谱柱中，多次重复脱盐过程，直到所有酶溶液都被脱盐为止。简而言之，首先将酶溶液（10 mL）通过0.45mu;m膜（德国Whatman的膜）注入到预先用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）平衡的Hi Prep 26/10脱盐柱（10 cmtimes;2.6 cm，瑞典Amersham Pharmacia Biotech）上。该色谱柱已安装到前面提到的FPLC。用相同的缓冲液以5 mL / min的流速洗脱蛋白质，最大压力低于0.15 m Pa。收集含有1 mL洗脱液的级分，并使用UV检测器在280 nm处监测每个级分中的蛋白质浓度。测试每个包含蛋白质的级分的5-PDE活性，合并具有高5-PDE活性的级分以备后用。

2.6阴离子交换色谱

来自脱盐过程的包含5-PDE的合并馏分总计为300 mL。对于每个阴离子交换色谱程序，将5 mL酶溶液通过0.2 micro;m膜滤器（美国Titan）过滤，然后将其上样至Hi-Trap DEAE Fast Flow色谱柱（5 cmtimes;1 cm），这是一种阴离子交换。色谱柱（Amersham Pharmacia Biotech，瑞典）。该柱用20 mM Tris缓冲液（pH 7.5）预平衡。上样后，用相同的缓冲液洗涤色谱柱。继续该过程，直到流出物在280 nm的光密度为零为止。以5 mL / min的流速收集两个毫升级分，最大压力低于0.3 m Pa。通过对每个级分进行活性分析，鉴定出具有高5-PDE活性的级分，以进行进一步纯化，然后合并。含有5-PDE的溶液的总体积为60mL。

2.7凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱法是在Superose 12

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