重组DNA人血清白蛋白技术:挑战与策略外文翻译资料

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重组DNA人血清白蛋白技术:挑战与策略

关键词:重组人血清白蛋白rHSA生物安全性 rHSA加工 OsrHSA 植物生物反应器

摘要

背景:作为血液中最丰富的蛋白质，人血清白蛋白(HSA)在维持血浆嗜酸压力和机体间室体液平衡方面起着重要作用。因此，HSA被广泛用于临床治疗疾病。然而，血浆HSA (pHSA)的短缺和安全性问题凸显了重组HSA (rHSA)作为血浆HSA替代物的重要性。

审查范围:这里，我们回顾了rHSA的生产，从表达到下游加工，强调了两种主要表达平台的可扩展性和成本效益。我们还讨论了商用药物rHSA在杂质和污染物方面的生物安全性，接着分析了临床前和临床试验的最新进展。我们强调生产药用级rHSA的挑战。

主要结论:rHSA可在多种宿主中高表达，与pHSA似乎相同。在一系列的临床前和临床试验中，从酵母中产生的rHSA 似乎与pHSA一样有效和安全，而从水稻种子中产生的rHSA则显示出更具有成本效益的生产潜力。性价比高且无不良反应的产品很可能在未来的人类疗法中发挥重要作用。

总体意义:我们对制药级rHSA生产的认识在方面有所提高，包括表达宿主、生化特性、下游`加工以及种杂质的检测和去除。然而，由于临床应用所需的大剂量，生产足够的个数量的rHSA仍然是一个挑战。这篇文章是《血清白蛋白》特刊的一部分。

1.引言

人血清白蛋白(HSA)是人血浆中最丰富的蛋白(40-50 g/L)，是一种亲水性、非糖基化蛋白，分子量约为66.5 kDa。HSA是在肝脏中合成的，主要作用是调节血浆胶体的嗜酸压力，以及作为许多外源性和内源性代谢物和药物[1]的载体。该蛋白在临床上广泛用于治疗低蛋白血症、胎儿成红细胞症、烧伤或失水休克、肝硬化引起的腹水等[2-4]。HSA也被用作辅料、稳定剂或细胞培养物的补充，用于重组药物的生产[5-7]。

在过去的几十年里，由于HSA的广泛应用，它的市场需求大大增加。对于HSA的医疗应用据评估全世界超过500吨。商业化生产主要是基于对人体血浆的分离，而这在中国、巴西和印度等国家受到献血的限制。此外，尽管近年来pHSA的制造已经有了很大的改进[8,9]，血浆源性HSA (pHSA)仍存在着传播血液源性病原体的潜在风险。因此，监管机构鼓励制药公司使用非动物来源的药物生产[10]。因此，利用重组DNA 技术生产HSA被作为获得大量无病原体HSA的替代方法。

不同的原核和真核宿主已被用于制造重组人血清白蛋白(rHSA)。然而，这些宿主中没有一个被证明在工业规模上具有成本效益。rHSA的生产面临着许多挑战，特别是在大规模生产和生物安全方面。在这篇综述中，我们讨论了来自不同表达系统的rHSA，主要集中在蛋白的表达水平，下游加工，成本效益，以及与杂质相关的安全问题。

1. rHSA的表达

临床应用需要高剂量的HSA，通常超过10克/剂量，如治疗低白蛋白血症或创伤性休克。因为HSA的单价非常低(每克$3.00 - $5.00)[11]。为了在经济上可行的水平上商业化生产rHSA，非常高的表达水平是最低要求[12]。大量沉积重组蛋白可在宿主中引发意外毒性作用，重组蛋白水平也可因降解或聚集而降低。此外，HSA由一个由585个氨基酸组成的单一多肽链组成，并折叠成三个螺旋结构域。HSA中有35个半胱氨酸，其中34个形成二硫键。这种复杂的二硫键的形成可能对蛋白质的合成和折叠系统造成负担，在宿主细胞中高表达rHSA时，可能导致低表达或不正确的折叠。因此，如果表达水平不够高，很难满足要求，处理成本效益不高。从那时起，在过去的几十年里，人们为提高rHSA的表达水平做出了许多努力，包括细菌、酵母、动物和植物细胞。然而，这些问题在最近的工作中并没有得到解决[13]。

2.1.rHSA在细菌中的表达

细菌，如大肠杆菌，最初被认为是最有效的生产rHSA的平台，因为这些微生物有成熟的分子工具，高生长速度和培养能力，以及重组蛋白[14]的显著产量。大肠杆菌是最早用于生产rHSA的宿主，也是目前最常见的各种重组蛋白的生产平台。将编码hsa基因的 cDNA插入到表达框中，转化为大肠杆菌。大肠杆菌的表达量约为2.5 g/L。大部分蛋白质是不溶性的，以包涵体的形式存在，这可能是由于蛋白质聚集和细胞质中缺乏适当的折叠[15,16]。枯草芽孢杆菌可分泌可溶性rHSA，但信号序列在n端处不正确切割[17]。我们知道，在不同的表达系统中，不正确的折叠或加工是不适合所有重组蛋白的生产的，特别是在原核生物如大肠杆菌中。然而，大肠杆菌通过折叠酶和伴侣蛋白的共表达成功表达了富含二硫蛋白的蛋白，这表明一种新的分子策略可以在原核生物中表达rHSA[16,18]。

2.2.rHSA在酵母中的表达

在真核生物中产生rHSA最初是具有挑战性的。在大肠杆菌中观察到rHSA在酵母中的表达会导致聚集，形成包涵体[19]。因此，从培养基中收集分泌蛋是酵母生产rHSA的主要策略[19-32]。为了获得成本效益生产rHSA，至少几克蛋白质必须分泌到培养基中，以开始的材料处理[12]。为了增强rHSA的表达，我们设计了不同的酵母菌株，包括酿酒酵母[19 - 23,33]、多形汉森酵母[24-26]、乳酸克鲁维酵母[27,28,34]和毕赤酵母[29-32]来表达工业用的rHSA。表达水平从毫克到克每升获得酵母采用不同的策略,如引入不同的启动子,hsa基因的内含子插入和使用的信号肽(表1)。此外,许多其他方法一直利用提高分泌水平,包括优化的培养基[35],使用循环馈料式[36]和重复馈料式文化[29,37]。

通过优化控制rHSA 表达的调控遗传元件和培养条件，包括酿酒酵母[22,38]和巴斯德酵母[29,30,35]在内的甲醇营养菌株似乎是最吸引人的工业化生产rHSA的选择。因为在酵母中控制目标基因表达的酒精氧化酶2 (AOX2)启动子非常强且受到严格的调控，所以这些菌株是较理想的。根据Novozymes(http://www.biopharma.novozymes.com/en/information-centre/posters-and-presentations/Documents/ACTIP08_LesEvans_181108.pdf)。使用AOX2启动子和重复补料发酵可使rHSA表达量提高149倍，在巴氏酵母中高达10 g/L[37,39]。

无论是酿酒酵母还是巴斯德酵母，都可以观察到rHSA的蛋白水解降解[19,29]，特别是在定期饲喂[22]的长时间培养中。这种降解被归因于内源性酸性蛋白酶，以酸性ph依赖的方式[22]。在pH值为 4.3的情况下，可以观察到高达660 mg /L/h的rHSA降解速率，这导致了酵母[29]中rHSA产量的显著下降。通过破坏编码天冬氨酸蛋白酶(YAP3)[21]的基因，一种减少HSA降解的策略已经得到。在酵母中引起rHSA不稳定性的假定蛋白酶仍不清楚。然而，为了减少现有的基于P. pastoris的蛋白表达系统中蛋白酶的影响，最近开发了一种名为PichiaPinktrade;的新系统。PichiaPinktrade;rHSA表达量达到334 mg/L，无明显降解[40]。随着降解问题的解决，在酿酒酵母和巴斯德酵母中都可以获得高而稳定的表达水平。这些级别适用于工业规模的rHSA生产，因此该系统正在为此目的采用(诺维信和三菱)。

表一 rHSA在不同宿主中的表达

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