分子功能和生物膜调节蓝光信号通路的潜在演变（大肠杆菌）外文翻译资料

 2022-08-08 11:30:28

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分子功能和生物膜调节蓝光信号通路的潜在演变（大肠杆菌）

概要

大肠杆菌通过BLUF-EAL蛋白BluF（YcgF）感知蓝光。 BluF的简并EAL结构域不具有环二GMP磷酸二酯酶活性，但BluF直接拮抗MerR样阻遏物BluR（YcgE），从而导致ycgZ-ymgABC操纵子的表达和Rcs系统的激活（Tschowri等等，2009； Genes Dev 23：522-534）。虽然bluR，bluF和ycgZ具有各自的转录起始位点，但比较基因组分析表明，bluR-bluF-ycgZ-ymgAB区代表各种肠细菌中的功能单元，其特征在于编码退化EAL结构域的bluF等位基因。 。重新引入与EAL域的磷酸二酯酶活性有关的保守氨基酸不能恢复BluF的酶活性或c-di-GMP结合，但会减弱其拮抗BluR的能力并改善与BluR旁系同源物MlrA的残余相互作用，后者控制表达。生物膜调节剂CsgD和卷曲纤维的断裂。我们在ycgZ启动子中鉴定了BluR结合位点，并观察到BluR还具有对MlrA依赖性csgD启动子的残留亲和力。总之，我们建议BluF从蓝光调节的PDE演变成MlrA复制品的特异性拮抗剂，该复制品变成BluR，不仅可以控制卷曲，还可以通过Ymg / Rcs途径控制各种生物膜功能。

介绍

大肠杆菌是一种革兰氏阴性肠杆菌，可以在宿主相关的生活方式和环境生活方式之间切换。它存在于哺乳动物的肠道以及外界条件下，例如在水生环境或土壤中。在自然的外部环境中，大肠杆菌能够通过感光蛋白YcgF感知并响应蓝光，该蛋白带有N端BLUF [使用FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）的蓝光]域（Gomelsky和Klug， 2002； Rajagopal等，2004； Nakasone等，2007； 2010）。 YcgF的BLUF结构域与C端EAL结构域相关联。通常，含EAL结构域的蛋白质起磷酸二酯酶（PDE）的作用，降解降解生物膜的第二种信使c-di-GMP（Hengge，2009； Schirmer and Jenal，2009）。但是，已知在EAL结构域的c-di-GMP结合中起关键作用的所有四个氨基酸，以及必需的催化谷氨酸和其他有助于PDE活性的氨基酸（Rao等人，2008）都不保守。在大肠杆菌的YcgF中（图S1）。一致地，在我们先前的研究（Tschowri等，​​2009）中，我们证明了YcgF不会结合或降解c-di-GMP，而与蓝光无关。相反，YcgF直接与类似MerR的阻遏物YcgE结合，并以光依赖性方式将其从其操纵基因中释放出来。 YcgE的失活导致ycgZ-ymgABC操纵子的表达升高，它在YcgE受体蛋白的直接控制下位于大肠杆菌染色体上的ycgE-ycgF旁边。 YcgF / YcgE控制的YmgB蛋白，在一定程度上还可以控制YmgA，可以通过激活Rcs磷酸酶系统调节生物膜功能，从而导致可乐酸产量增加和卷曲纤维合成的下调（Tschowri等，​​2009）。

YcgE代表MlrA（一种类似MerR的调节物，直接激活重要的生物膜调节物CsgD的转录）的密切相关的类似物（Brown等人，2001； 2003； Ogasawara等人，2010）。在大肠杆菌和其他肠细菌中，CsgD被证明可以正向调节csgBAC编码的卷曲纤维的合成（Rouml;mling等，1998； 2000； Brombacher等，2003）。为了激活csgD，MlrA与磷酸二酯酶YciR和双鸟苷酸环化酶YdaM协同作用（Weber等人，2006），这三种蛋白表现出多种直接相互作用（S. Lindenberg和R. Hengge，未发表数据）。

YcgE和MlrA中的两个结构域均具有很强的序列保守性（图S2），并且两种蛋白均与EAL结构域蛋白相互作用，这表明这两种蛋白具有直接的共同祖先。此外，存在于多种细菌中的YcgF出现在活性PDE和抗阻遏蛋白之间的不同“进化中间体”中（图S1）。就PDE活性必不可少的残基而言，大肠杆菌的YcgF蛋白是最退化的变体（Tschowri等，​​2009），而肺炎克雷伯菌中两个YcgF同源物之一BlrP1具有蓝色。光调节的磷酸二酯酶活性（Barends等，2009）。总的来说，似乎很明显，最近的进化发生在ycgE-ycgF-ycgZ-ymgABC基因组区域，通过这项研究，我们进一步表征了YcgF-YcgE-Ymg途径组分的表达和分子功能，以及旨在深入了解其潜在发展。

在这里，我们显示ycgE-ycgF-ycgZ-ymgAB区代表在各种肠细菌中保守的功能单元。比较基因组分析表明，在该遗传单位内编码的YcgF同源物通常显示出一定程度的变性。此外，某些物种，例如肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）编码其他酶促活性的YcgF变异体，这表明YcgF最初是在基因复制后由活性的PDE进化而来。然而，重新引入PDE活性通常需要的所有氨基酸并不能恢复大肠杆菌YcgF的酶活性或c-di-GMP结合，但是却削弱了其拮抗YcgE的潜力，因此证明YcgF是不仅是有缺陷的PDE，还特别适合与YcgE交互。另一方面，在简并的YcgF的EAL域中恢复共有氨基酸可提高对YcgE旁系同源MlrA的残留亲和力。而且，显示YcgE具有与MlrA控制的csgD启动子的残留结合能力。

最后，根据其他研究人员对更有意义的基因名称的要求，我们现在还建议重命名这些基因，即ycgF的“ bluF”和ycgE的“ bluR”，并将在下文中使用这些名称。

结果

大肠杆菌染色体上bluR-bluF-ycgZ-ymgABC区的遗传组织

通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用，大肠杆菌的BluF（YcgF）蛋白以依赖于蓝光的方式干扰MerR样蛋白BluR（YcgE）与ycgZ启动子的结合（Tschowri等，​​2009）。 。 ycgZ是ycgZ-ymgA-ymgB-ymgC操纵子的第一个基因，它编码四个小蛋白，并位于被发散转录的控制区隔开的bluR-bluF区附近（图1C）。 Northern印迹分析表明ycgZ-ymgA-ymgB-ymgC在单个多顺反子mRNA中表达。此外，基于报告基因融合实验（Tschowri等，​​2009），我们认为bluR和bluF不构成操纵子。在这项研究中，我们通过确定bluR，bluF和ycgZ的转录起始位点来补充这些数据。

通过引物延伸实验（图1A和B）确定的bluR，bluF和ycgZ的5-mRNA末端分别位于相应翻译起始位点上游54、30和36个核苷酸。这些结果表明bluR和bluF是独立转录的。与s70和sS依赖性启动子的共有序列一致（图1B）（Typas等，2007），已知bluR和bluF可以被含s70的RNA聚合酶（RNAP）转录，而ycgZ-ymgABC操纵子处于sS控制下（Tschowri等，​​2009）。在18 bp的情况下，BluR调控的基因ycgZ启动子区域中-35和-10元件之间的间隔与含sS的RNAP的识别以及与MerR样调控子的控制一致。结合与表现出间隔物长度大于17bp的启动子区域重叠（Brown等，2003）。

知道bluR-bluF-ycgZ-ymgABC在共同的调控途径中起作用，我们想知道该功能性遗传单位是否在其他肠道细菌中保守。使用EcoCyc（Keseler等，2011）和BLAST（Altschul等，1997）提供的多基因组比对工具，我们发现，即使是紧密相关的物种，其所含BluF同源物的数量也有所不同。当前测序的耶尔森氏菌和沙门氏菌中没有一个具有这种感光蛋白，而大肠杆菌K-12和柠檬酸杆菌属每个都具有一个BluF蛋白，而克雷伯菌和肠杆菌属甚至都具有两个BluF版本。此外，存在于这些肠细菌中的BluF蛋白相对于c-di-GMP依赖性磷酸二酯酶活性所必需的关键氨基酸表现出不同程度的EAL结构域变性（Rao等，2008），而E中的BluF代表最简并变异体的大肠杆菌（图S1）。

图1. bluR，bluF和ycgZ-ymgABC操纵子的遗传组织和转录起始位点。

A.通过引物延伸确定bluR，bluF和ycgZ-ymgABC操纵子的转录起始位点。如实验步骤所述，对MC4100野生型细胞（泳道1）和含有带有bluR，bluF和ycgZ启动子区域的质粒（泳道2）或相应的敲除突变（泳道3）的衍生物进行RNA分离和引物延伸。含质粒的菌株中含量较高且突变体中不存在的最长逆转录物代表转录起点，并以星号（*）突出显示。 B.bluR，bluF和ycgZ启动子区的序列。假定的-35和-10区域以及Es70和Es70共有序列用方框框起来，转录起始位点用

箭头。

C.大肠杆菌的bluR-bluF-ycgZ-ymgABC区域与肺炎克雷伯菌肠杆菌属的相应区域的遗传组织。和由EcoCyc提供的多基因组比对工具获得的鸟博德特氏菌。

来自肺炎克雷伯氏菌的KPK_2789蛋白（也称为BlrP1）显示出对PDE活性必不可少的所有残基，并且实际上被证明可作为蓝光调节的PDE（Barends等，2009）。另外，肺炎克雷伯氏菌具有第二个BluF同源物KPK_3794，其编码与KPK_3793的基因相邻（图1C）。后一种蛋白被标注为“ MlrA”，但实际上与大肠杆菌中的BluR具有65％的同一性，仅与MlrA具有48％的同一性，而肺炎克雷伯氏菌染色体中的另一个类似MerR的蛋白（KPK_4910）显示37与BluR的同一性为％，与MlrA的同一性为44％。有趣的是，与更像BluR的KPK_3793形成编码单元的BluF同源物KPK_3794携带了部分简并的EAL域，该域缺失了参与c-di-GMP结合的天冬氨酸以及参与结合到谷氨酸的谷氨酸。辅助因子Mg2 。此外，该遗传单位与与大肠杆菌中ycgZ-ymgAB区有关的小操纵子相关（无ymgC；图S1和1C）。

在肠杆菌属中发现了类似的情况。 638，它不仅具有两个BluF同源物，而且具有两个BluR相关的MerR样蛋白。在这两种BLUF-EAL蛋白中，Ent638_2032显示了一个典型的EAL结构域蛋白，最有可能充当PDE，而Ent638_1757则在一定程度上退化并与BluR同源Ent638_1758和ycgZ-ymgAB样小基因形成编码单位（图1C）。最后，没有任何BluR同源物但携带具有共有EAL结构域的BluF样蛋白的基因，因此极有可能具有PDE活性的鸟叫Bordetella avium和Maceleodii则代表另一个极端，即似乎具有蓝色调光的PDE，但不具有BluR及其目标操纵子ycgZ-ymgAB。

综上所述，这些观察结果表明细菌中存在BluF的不同进化中间体，并且每当细菌基因组中存在编码具有简化EAL域的蛋白质的bluF同源物时，它通常位于类似MerR样BluR基因的旁边。相关蛋白和ycgZ-ymgAB样遗传单位（图1C）。

BluF简并EAL结构域中共有氨基酸的还原不能重建PDE活性，但会降低其拮抗BluR的能力

由于BluF存在于活性PDE（如肺炎克雷伯氏菌中的BlrP1）和现在充当抗阻遏物的简并EAL结构域蛋白（如E. coli中）之间的不同中间变体中，我们想知道是否有可能进行“反向”进化”，并通过引入酶促活性所需的关键氨基酸使大肠杆菌BluF蛋白“返回”突变为活性PDE（见图S1）。因此，我们产生了一系列的BluF突变体变体，其与共有的EAL结构域（M2-M8，请参见实验程序）的相似性不断提高。使用放射标记的c-di-GMP在体外测试纯化的蛋白的磷酸二酯酶活性和c-di-GMP结合能力。与活性磷酸二酯酶YhjH（Pesavento等，2008）或双鸟苷酸环化酶PleD *（Chan等，2004）相比，BluF变体均无法裂解或结合c-di-GMP（图S3A和B）。

还测试了这些突变的BluF版本在体内降解c-di-GMP的能力。为此，将W3110的yhjH :: kan突变体衍生物（由于细胞c-di-GMP水平升高而在运动性方面受到损害（图S3C））（Pesavento等人，2008）用编码pQE30Xa的衍生物转化。不同的BluF变体。活力的降低可以通过YhjH的表达（甚至如图S3C所示从低拷贝数的质粒pCAB18中表达）或另一种活性PDE的表达来抑制。 YciR（C。Pesavento和R. Hengge，未发表结果）。因此，我们期望任何质粒编码的酶活性BluF突变体变体都能抑制yhjH突变体的非运动型表型。然而，从pQE30Xa表达的任何突变BluF蛋白都无法恢复yhjH突变体的运动能力（图S3C）。所有这些结果表明，引入有助于c-di-GMP结合和裂解以及Mg2 结合的关键氨基酸不足以恢复BluF中的PDE活性。

但是BluF中的这些氨基酸交换是否会改变其拮抗阻遏蛋白BluR的能力？为了测试这一点，在带有ycgZ :: lacZ报告基因融合体的W3110衍生物中表达了相同的pQE30Xa编码的BluF变体，该基因融合了代表在BluF / BluR控制下的靶基因，并测试了它们抑制ycgZ的潜能： ：lacZ。如图2所示，只有突变最少的BluF-M2（BluFI193L Q195R）变体（其中退化的基序EAIVQ被共识签名EALVR替代）仍然能够抑制ycgZ :: lacZ的表达。程度与从同一载体表达的野生型BluF相同。尽管具有与野生型蛋白相同的表达水平，但具有较高氨基酸交换数量（M4–M8）的BluF变体显示出降低ycgZ :: lacZ的拮抗能力，因此拮抗BluR。

总而言之，重新引入通常在酶促活性EAL结构域中保留的氨基酸并不能恢复BluF的PDE活性，反而会削弱其抵抗BluR的能力。因此，BluF不仅是有缺陷的PDE，而且在进化上已经适应于绑定和拮抗BluR。

图2. EAL域中共有氨基酸的还原降低了BluF抑制ycgZ :: lacZ表达的能力。在携带pQE30Xa编码的野生型BluF以及突变体变体的W3110衍生物中确定了单拷贝染色体ycgZ :: lacZ融合体的表达（有关突

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