丙氨酸生产中酶促级联反应的优化外文翻译资料

 2022-08-08 14:42:51

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  1. 丙氨酸生产中酶促级联反应的优化

摘要：无细胞酶促级联反应结合了体外生物催化和体内多步途径反应的优点。由于缺少严格规划的细胞环境，使得我们可以直接进行过程控制，例如快速的识别关键决速步骤和过程优化。在这项工作中，我们开发了一种酶促级联反应，用于直接从D-葡萄糖和硫酸铵生产L-丙氨酸。一种有效的，基于活性酶的选择性证明了级联反应的两个分支。这种还原酶反应级联反应由一个葡萄糖脱氢酶、两个二羟酸脱水酶、一个酮脱氧醛缩酶、一个醛脱氢酶和一个L-丙氨酸脱氢酶组成。这种纯化生物催化剂的人工组合消除了磷酸化的需要，只需要最佳辅助因子（NAD）。我们通过应用荧光胺技术对L-丙氨酸进行定量分析，提供了细节优化过程参数。同时确定了最佳的酶比和所需的酶负荷，并确定了NAD、铵和缓冲液浓度，主反应产率＞95%，其中副反应产率为8%。

介绍：

在一个石油资源主导的世界中，可持续性是现代研究的焦点。为了避免化石资源的枯竭，需选择一种可持续的方法，并将其纳入工业生产。有前景的研究方向是生物模拟自然途径或人工设计级联反应，这两种方法可以作为有力的工具，因为自然进化演变已经找到在几乎相同的条件下转化大量底物的方法。利用生物进行生物产品生产的多种方法结合起来，可以进一步增强其作为能源、燃料或化学品可再生平台的潜力。对酶进行修饰以解决特定的问题增加了它们应用的广泛性。在过去的几十年里，发展出两种不同的方法，一种是细胞代谢工程，另一种是将来自不同生物体的纯化酶结合到体外酶反应级联反应中。后一种方法被称为“体外合成生物系统”，“体外代谢工程”，“合成途径设计”。生物催化剂在一定环境下与必须的辅助因子结合以生产出有价值的产品。这种方法结合了生物催化的优势和多步体内反应，形成了一种高水平生物产品制造方法。与传统的微生物发酵相比，它们受细胞毒性化合物的影响较小，无需考虑细胞膜运输，可以对其进行直接调控。应用耐热酶可减少蛋白质纯化所需的时间，提高高温下的工艺稳定性。目前，已经报道了大量成功的实例，这些实例采用了用于生产例如醇、手性胺、糖或氢的在无细胞环境下酶促级联反应。由于不在严格规定的细胞环境内，使得我们可以直接控制反应中的某个步骤，进一步优化这种酶级联反应，并显著提高经济性，为了确定合适的酶比，避免不必要的费用，一种方法是对所需的生物催化剂进行全面的动力学分析，包括抑制常数和pH值效应，如Beer等人所示。另外一种方法是经典酶滴定法，一次只改变一种酶的比率，然后确定在最大产率下最佳的酶比。

在这项工作中，我们设计了一个无细胞酶级联直接从葡萄糖和硫酸铵生产L-丙氨酸。作为最小的手性化合物之一，L-丙氨酸用于各种领域，例如用作食品/饲料添加剂（L-丙氨酸是唯一具有甜味的L-氨基酸）、用于营养治疗的保健行业（例如Travasolreg;的主要成分）以及可能用作定制热塑性,的未来原料。尽管各种生物已被证明能积累L-丙氨酸，但目前的工业生产依赖于假单胞菌的静息细胞生物转化。从经济角度来看，kappa;-卡拉胶固定化细胞使得该工艺非常可行，因为衍生生物催化剂的半衰期在37°C下为260 d，并且通过简单的离子交换树脂纯化步骤可以达到gt;90%的分离L-丙氨酸产率。然而，底物L-天冬氨酸将这一过程与以石油为基础的富马酸铵生产相结合。为了使这一过程可持续发展，我们的无细胞反应级联的设计受到了来自超嗜热古菌的非磷酸化Entner-Doudoroff途径的启发。我们之前已经描述了一种将D-葡萄糖转化为乙醇的人工糖酵解级联反应，它只包含六种酶而不需要磷酸化，并且只包含NAD作为氧化还原穿梭子16。继续这项工作，我们确定了通过葡萄糖酸盐、2-酮基-3-脱氧葡萄糖酸盐、甘油醛和甘油酸盐向丙酮酸盐转化葡萄糖的改良酶变体。与黄曲霉L-丙氨酸脱氢酶结合，仅使用五到六种酶即可获得氧化还原中性的L-丙氨酸生成反应级联（图1）。对于酶比的最终优化，我们将上述两种方法结合起来，首先确定动力学常数，然后根据生物催化剂的最大活性对其进行滴定，以实现整体效率的提高。

图1 已开发的L-丙氨酸无细胞反应级联的示意图。氧化还原中性是通过D-葡萄糖和D-甘油醛的氧化与丙酮酸的还原胺化相结合来实现的。

结果和讨论：

级联反应设计：从我们先前发表的体外酶级联反应到乙醇/异丁醇，发展了一种用于D-葡萄糖转化为L-丙氨酸的无细胞酶级联反应。在第一步中，D-葡萄糖在NADH的形成下被氧化成D-葡萄糖酸盐。然后，D-葡萄糖酸盐脱水形成2-酮基-3-脱氧D-葡萄糖酸盐（KDG），然后进行逆羟醛缩合反应，得到一个分子丙酮酸盐和一个分子D-甘油醛。醛被氧化产生另一当量的NADH和D-甘油酯，后者进一步转化为第二个丙酮酸分子。在先前发表的级联反应中，丙酮酸被脱羧成乙醛并进一步还原成乙醇，我们修改了最后的步骤，直接将丙酮酸还原胺化合成L-丙氨酸，同时回收NAD。通过这种氧化还原中性级联反应，每个葡萄糖分子可以形成两个L-丙氨酸分子，NAD是唯一的辅因子（图1）。虽然乙醇或异丁醇对酶的影响现在可以忽略，但是氨需要存在于L-丙氨酸的形成中，并且需要研究对生物催化剂的可能抑制作用。由于大多数游离氨基酸倾向于稳定蛋白质，因此L-丙氨酸的抑制作用是不可预期的。

基于酶活力的选择性：从乙醇级联反应了解瓶颈和缺点，我们的目标是确定丙酮酸合成模块更有效的酶变体。这种改进的酶组与高活性L-丙氨酸脱氢酶的组合应产生优化的氧化还原中性酶级联（图1）。

在反应起始阶段，通过添加D-葡萄糖和NAD开始级联反应，葡萄糖脱氢酶（GDH）将初始底物转化为D-葡萄糖酸盐和NADH。以前，为了保证其在工艺温度（50°C）下的稳定性，所以应用了极端嗜硫菌Sulfolobus solfataricus的GDH。SsGDH的vmax（15u/mg）与其他gdh相比处于较低的范围。通常中温宿主的酶在中等温度下表现出较高的活性，但通常缺乏稳定性，降解相对较快。Bommarius等人可以通过引入两个点突变来提高枯草芽孢杆菌GDH的热稳定性，同时保持其高比活性。在最终工艺条件下，与我们先前应用的SsGDH相比，这种双突变体BsGDH对D-葡萄糖的活性提高了14倍，从而降低了酶负荷，从而提高了系统的经济性。D-葡萄糖酸盐向KDG的脱水是由二羟酸脱水酶（DHAD）催化的。在乙醇级联反应中，由于其对相关底物D-葡萄糖酸盐和D-甘油酸盐都具有活性，并且具有较高的耐热性和在大肠杆菌中的良好表达能力，因此应用了磺基地黄DHAD。在另一项研究中，我们发现首选的D-葡萄糖酸盐反应被D-甘油酯抑制，从而减缓了整个级联反应。通过应用两个独立的脱水酶，我们试图绕过这个问题，并提高整体级联周转。由于SsDHAD是迄今为止唯一能够催化D-甘油酯脱水的生物催化剂，因此不可能进行替代。因此，我们想要找到一种改良的D-葡萄糖酸转化酶。不幸的是，我们在古细菌葡萄糖酸脱水酶的表达过程中遇到了溶解度问题，据报道，这种酶对热降解非常活跃和稳定。在我们的实验中，一种来自新月形茎杆菌的高活性中温DHAD（CcDHAD）被发表在。在我们的手中，CcDHAD在D-葡萄糖酸盐上的活性大约是SsDHAD的40倍，相当于29U/mg的比活性，尽管这是以降低热稳定性为代价的。脱水产物（KDG）进一步经受可逆的逆羟醛缩合反应。在这一点上，该途径是由醛缩酶形成的D-甘油醛和丙酮酸分支。先前应用的酸钙藻KDGA的KM相对较高（~14thinsp;mM），结合中等vmax（4 U/mg）。从一系列候选酶中，从极端嗜热菌P.torridus（PtKDGA）33中筛选出具有大约3倍高活性的高度特异性醛缩酶。通过KDG裂解得到一个丙酮酸当量，在随后的还原胺化反应中可以直接再生一个NAD当量。对于这最后一步，文献中描述了多种L-丙氨酸脱氢酶。其中，枯草芽孢杆菌和极端嗜古菌黄球菌的酶根据其活性和pH依赖性等特性进行了进一步的研究。虽然这两种生物催化剂都可以在大肠杆菌中以可溶性形式生产，并且最适pH值在ph9左右，但AfAlaDH因其优异的长期热稳定性而被选中。被定义为主要分支，该途径通过GDH、DHAD、KDGA和AlaDH可以有效地作为氧化还原中性级联产生L-丙氨酸和D-甘油醛。考虑到我们工艺的经济性，D-甘油醛需要进一步转化，以消除副产物，并使理论L-丙氨酸产量加倍。醛的氧化以前是由嗜酸热浆菌突变的醛脱氢酶（ALDH）38完成的。由于原酶是严格依赖NADP的，定向进化突变导致了NAD39的一些活性。尽管NAD的KM保持相对较高（~17thinsp;mM），但这种酶在乙醇级联反应中的突出优势是其对D-甘油醛的专一活性，对同样存在的乙醛没有副反应。由于丙氨酸级联不再依赖于这种专一性活性，我们决定使用jannaschii甲醛酸球菌的ALDH来代替，因为它具有更高的表达率和NAD的特异性。侧支路的第二步是D-甘油酯脱水以获得另一当量的丙酮酸盐。虽然天然糖酵解途径需要磷酸化，但我们先前可以证明SsDHAD成功用于D-甘油酸的直接脱水16。尽管活性相当低（~10ug/mg）32，但这种反应使我们的无激酶策略成为可能。由于D-甘油酯是CcDHAD的强竞争性抑制剂（KI为~0.5thinsp;mM），我们尝试通过施用尽可能多的SsDHAD来避免其累积。表1总结了所有生物催化剂的动力学特性。

不同铵源的分析:L-丙氨酸的形成是通过还原丙酮酸与黄曲霉L-丙氨酸脱氢酶胺化实现的。在我们手中，AfAlaDHKM大约比文献报道的高出10的36次方倍。正因为如此，我们必须确定一个浓度的铵，促进高活性的AfAlaDH，同时不抑制其他生物催化剂。此外，我们还认识到反离子对级联生物催化剂活性的不同影响。以氯化铵和硝酸铵为一价化合物，硫酸铵和磷酸二铵为二价铵源，进行了活性测定。如表2所示，BsGDH通常由铵激活（氯化铵为33%），而只要存在铵，AfAlaDH几乎不受铵源类型的影响。PtKDGA和CcDHAD在存在单价铵源的情况下活性显著降低或没有活性。总的来说，硫酸铵对所有酶都有耐受性，CcDHAD和PtKDGA的活性分别为60%和70%。对于AlaDH，最终浓度为200thinsp;mM的铵被选择在KM范围内，同时仍然不促进对其他酶的进一步抑制。

丙氨酸检测：复杂基质中氨基酸（包括L-丙氨酸）的检测通常通过HPLC进行，使用柱前衍生，例如邻苯二甲醛（OPA）。由于每个样品的运行时间相对较长，我们的目标是确定一个快速比色分析，这是符合我们的酶和铵基质。我们比较了改进的Berthelot反应、OPA、茚三酮和荧光素，以获得适合我们系统的最佳产物监测平台。Berthelot反应是指用苯酚和次氯酸盐对铵进行碱性衍生化，以定量测定游离铵。从残余铵浓度，我们想推断丙氨酸浓度，但这些测量是不令人满意的。其他三种化合物是胺的衍生化和定量的常用试剂。特别是一级氨基可以与这些检测试剂反应，产生发色团或荧光团。但是，氨还会与这些化合物发生反应，形成类似的产物，从而干扰丙氨酸的检测。对于OPA和茚三酮，基质中过量的铵对测量有显著影响，并妨碍L-丙氨酸的准确定量。相反，荧光素胺衍生化对L-丙氨酸在铵上表现出足够的选择性，因此选择直接定量产生的L-丙氨酸而无需任何预纯化（图S1）。在复合酶/铵基质中，在1至30 mM L-丙氨酸范围内，校准呈线性（图S1）。进一步避免NADH荧光影响（lambda;exthinsp;=thinsp;366thinsp;nm（活培养中），lambda;emthinsp;=thinsp;460 nm43），在12thinsp;h后进行终点测量。

初始L-丙氨酸产量：由于我们从乙醇级联反应中了解到D-甘油酯脱水相对较慢，因此我们决定在积累D-甘油醛的同时，以BsGDH、CcDHAD、PtKDGA和AfAlaDH为主要分支开始级联反应的优化。一个单独的优化应该避免NAD库的风险，在那里每一个消耗的NAD分子都被暂时捕获，直到丙酮酸从甘油形成。50thinsp;°C、100thinsp;mM HEPES、pH 7.35、25thinsp;mM D-葡萄糖和5thinsp;mM NAD的起始条件已根据我们之前的级联设置16进行了调整。与100thinsp;mM硫酸铵一起，酶反应在50thinsp;C下培养12thinsp;h。对于最初的L-丙氨酸生产，生物催化剂的活性调整为彼此的1:1比例，这些活性的总和被定义为级联内的总单位。总酶负荷的逐步增加导致5.6 U/ml总酶的L-丙氨酸产率线性增加至约90%（图2）。

图2 比较优化酶比和1:1酶比不同酶负荷下L-丙氨酸产量。在相同的酶负荷下，优化的比例提高了酶的性能和L-丙氨酸的产量。反应中含有优化的酶比BsGDH:CcDHAD公司:PtKDGA:阿法拉德thinsp;=thinsp;2:10:1:2或所有酶的1:1比例。

  1. 丙氨酸生产工艺的优化

为了提高D-葡萄糖生产L-丙氨酸的效率，同时使用最少的酶，对酶的配比进行了优化，然后对辅助因子、缓冲液和铵浓度进行了优化。应用上述起始条件，每种酶的浓度设定为0.4u/mL，CcDHAD逐渐增加。如图3所示，L-丙氨酸产量稳定地增加到90%，而体积活度高于2thinsp;U/mL时没有进一步增加。因此，此酶浓度用于进一步的优化反应。PtKDGA的类似优化导致大约定量的产量为0.2thinsp;U/mL，而AfAlaDH的理想产量为0.4thinsp;U/mL。这导致BsGDH:CcDHAD:PtKDGA:AfAlaDH的优化酶比为thinsp;2/10/1/2。有趣的是，辅助因子循环酶BsGDH和AfAlaDH的比例为1:1，而只需要相当于PtKDGA的一半。所需的过量CcDHAD可能是由于其较低的热稳定性。下一步我们用优化的酶比来确定缓冲液、NAD和铵的最佳配比。3mM NAD和75mM硫酸铵的L-丙氨酸产率最高（97%）（图4）。对于HEPES缓冲液优化，采用上述酶负载量的50%，暂时增加缓冲液对系统的影响。结果与我们的其他实验相关，我们发现产品产量在100thinsp;mM之前呈线性增加，这相当于与25thinsp;mM葡萄糖负荷相比多出4倍。由于在葡萄糖氧化途径中形成酸，这种过量是必需的。最后，我们重复总酶负荷实验，将优化后的酶与1:1的酶比例进行比较（图2）。虽然这两条曲线都线性增加到L-丙氨酸产量的90%以上，但优化的酶比已经在3thinsp;U/mL达到最大值，而为了获得相同的L-丙氨酸产量，经典的1:1比例几乎需要两倍的酶量

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